304 uamea uamea coil tubing vaega vailaʻau, O le fausaga o le SPACA6 ectodomain o loʻo i ai se faʻasao sili o polotini e fesoʻotaʻi ma gamete fusion.

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O le SPACA6 o se polotini i luga o le sperm-faʻaalia e taua tele mo le fusuaga gamete i le taimi o le toe gaosia o feusuaiga.E ui lava i lenei matafaioi taua, o le galuega patino a le SPACA6 e le malamalama lelei.Matou te faʻamalamalamaina le fausaga tioata o le extracellular domain o le SPACA6 i se iugafono o le 2.2 Å, faʻaalia se palatini lua-domain e aofia ai se fusi faʻamaufaʻailoga e fa ma Ig-pei o β-sandwiches faʻapipiʻi e fesoʻotaʻiga faʻapitoa.O lenei fausaga e foliga tutusa ma le IZUMO1, o le isi gamete fusion-sociated protein, e avea ai le SPACA6 ma le IZUMO1 o sui faavae o le superfamily o le fertilization-related proteins o loʻo taʻua iinei o le IST superfamily.O le IST superfamily o lo'o fa'amatalaina fa'atulagaina e ala i lona fusi fa-helix milo fa'atasi ma se pea o le CXXC e feso'ota'i disulfide motifs.O se su'esu'ega a le AlphaFold e fa'avae i luga o le fausaga o le puipuiga a le tagata na fa'ailoa mai ai isi vaega o porotini o lenei aiga sili;aemaise lava, o le tele o nei polotini o loʻo aʻafia i le fusi o gamete.O le fausaga o le SPACA6 ma lona sootaga ma isi sui o le IST superfamily e maua ai le fesoʻotaʻiga o loʻo misi i lo tatou malamalama i le fusiga o le mammalian gamete.
O olaga uma o le tagata e amata i le lua haploid gametes eseese: o le sua o le tama ma le fuamoa a le tina.O lenei sperm o le manumalo lea i se faiga filifiliga malosi lea e ui atu ai le faitau miliona o sela sperm i totonu o le itupa o tamaʻitaʻi, faʻatoʻilaloina faʻalavelave eseese1 ma maua ai le malosi, lea e faʻaleleia ai lo latou gaogao ma le faagasologa o vaega i luga ole laiga2,3,4.E tusa lava pe maua e le sperm ma le oocyte le tasi ma le isi, e leʻi maeʻa le faagasologa.O le oocyte o loʻo siomia e se vaega o sela cumulus ma se paʻu glycoprotein e taʻua o le zona pellucida, lea e tatau ona ui atu ai le sperm e ulu atu i le oocyte.O le Spermatozoa e fa'aogaina le tu'ufa'atasiga o molela'au pipi'i i luga ma le membrane e feso'ota'i ma fa'alilo enzymes e fa'ato'ilaloina ai nei pa5.O nei mole mole ma enzymes e tele lava ina teuina i totonu o le membrane i totonu ma le acrosomal matrix ma e iloa pe a lysed le membrane pito i fafo o le sperm i le taimi o le acrosomal reaction6.O le la'asaga mulimuli i lenei malaga malosi o le fusu'aga fuamoa fuamoa, lea e fa'afefiloi ai e sela e lua o latou tino e avea ma organism diploid e tasi7.E ui lava o lenei faagasologa o le suatiaina o le eleele i le toe gaosia o le tagata, o fegalegaleaiga mole mole talafeagai e le o malamalama lelei.
I le faaopoopo atu i le fertilization o gametes, o le kemisi o le fusi o lua lipid bilayers ua suʻesuʻeina tele.I se tulaga lautele, o le fusuaga o le membrane o se faiga e matua le lelei lava lea e manaʻomia ai se protein catalyst e faia ai se suiga faʻatulagaina faʻavae e faʻapipiʻi vavalalata faʻatasi ai membranes e lua, malepelepe lo latou faʻaauau ma mafua ai le fusi8,9.O nei polotini catalysts ua ta'ua o fusogens ma ua maua i le tele o faiga fusi.E mana'omia mo le ulu atu o siama i totonu o sela talimalo (fa'ata'ita'iga, gp160 i le HIV-1, fa'aoso i coronaviruses, hemagglutinin i fa'ama'i influenza) 10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 ma fusuaga fai gamete i lalo ifo o eukaryotes ( HAP2/GCS1 i laau, protist ma arthropods) 16,17,18,19.Fusogens mo gametes a tagata e leʻi maua, e ui o le tele o polotini ua faʻaalia e taua tele mo le faʻapipiʻi ma le fusuaga.O le CD9 o loʻo faʻaalia oocyte, o se porotini transmembrane e manaʻomia mo le tuʻufaʻatasia o le isumu ma gametes tagata, o le mea muamua lea na maua 21,22,23.E ui lava e le o manino lona aoga, o se matafaioi i le pipii, le fausaga o le faʻapipiʻi faʻapipiʻi i luga o fuamoa microvilli, ma / poʻo le faʻaogaina saʻo o polotini luga o le oocyte e foliga mai e 24,25,26.O polotini masani e lua e taua tele mo le fusuaga gamete o le sperm protein IZUMO127 ma le oocyte protein JUNO28, ma o la latou fegalegaleaiga soofaatasi o se laasaga taua i le iloa o le gamete ma le pipii aʻo leʻi faʻafefiloi.Male Izumo1 knockout isumu ma le fafine Juno knockout isumu e matua sterile, i nei faataitaiga sperm ulu atu i le perivitelline avanoa ae gametes e le fuse.E faʻapea foʻi, na faʻaitiitia le feʻaveaʻi pe a togafitia gametes ma anti-IZUMO1 poʻo JUNO27,29 antibodies i faʻataʻitaʻiga fertilization in vitro tagata.
Talu ai nei, na maua ai se vaega fou o sperm-expressed proteins phenotypically tutusa ma IZUMO1 ma JUNO20,30,31,32,33,34,35 ua maua.Sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) ua faʻamaonia e taua mo le faʻamaʻiina i se suʻesuʻega mutagenesis murine tele.O le faʻaofiina o le transgene i totonu o le Spaca6 gene e maua ai le spermatozoa e le mafai ona faʻaaogaina, e ui lava o nei spermatozoa e faʻafefe i le perivitelline space 36 .O suʻesuʻega tuʻituʻi mulimuli ane i isumu na faʻamaonia ai e manaʻomia Spaca6 mo le gamete fusion 30,32.O le SPACA6 o loʻo faʻaalia toetoe lava i totonu o suʻega ma o loʻo i ai se mamanu faʻapitoa e tutusa ma le IZUMO1, e taʻua i totonu o le intima o le spermatozoa aʻo leʻi oʻo i le acrosomal reaction, ona malaga atu lea i le equatorial region pe a uma le acrosomal reaction 30,32.Spaca6 homologues o loʻo i ai i le tele o mammals ma isi eukaryotes 30 ma o lona taua mo le fusuaga gamete tagata ua faʻaalia e ala i le faʻasaina o le faʻamaʻiina o tagata in vitro e ala i le tetee atu i le SPACA6 30.E le pei o IZUMO1 ma JUNO, o faʻamatalaga o le fausaga, fegalegaleaiga, ma galuega a SPACA6 e tumau pea le le manino.
Ina ia malamalama atili i le faʻagasologa autu o loʻo faʻavaeina ai le fusuaga a le tagata ma fuamoa, lea o le a mafai ai ona matou faʻamalamalamaina atinaʻe i le lumanaʻi i fuafuaga a le aiga ma togafitiga o fualaʻau, na matou faʻatautaia suʻesuʻega a le SPACA6 ma suʻesuʻega biochemical.O le fausaga tioata o le vaega faaopoopo o le SPACA6 o loʻo faʻaalia ai se faʻamaufaʻailoga e fa-helical (4HB) ma se immunoglobulin-pei (Ig-pei) faʻafesoʻotaʻi e vaega e mafai ona fetuutuunai.E pei ona valoia i suʻesuʻega talu ai, 7,32,37 o le fausaga o le SPACA6 e tutusa ma le tagata IZUMO1, ma o le lua palatini e faʻasoa se faʻailoga e le masani ai: 4HB faʻatasi ai ma se tafatolu tafatolu luga ma se pea o disulfide-linked CXXC motifs.Matou te tuʻuina atu o le IZUMO1 ma le SPACA6 o loʻo faʻamatalaina nei se tele, faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻatasi o polotini e fesoʻotaʻi ma gamete fusion.I le faʻaaogaina o foliga faʻapitoa i le aiga sili, na matou faia ai se suʻesuʻega vaivai mo le AlphaFold structural human proteome, faʻamaonia nisi sui o lenei aiga sili, e aofia ai le tele o tagata o loʻo aʻafia i le gamete fusion ma / poʻo le fertilization.Ua aliali mai nei o loʻo i ai se gauga masani masani ma le sili o polotini e fesoʻotaʻi ma le fusuaga gamete, ma o lo tatou fausaga e maua ai se faʻafanua mole o lenei vaega taua o le masini fusuaga gamete tagata.
O le SPACA6 o se porotini transmembrane e tasi-pass ma le tasi N-linked glycan ma ono putative disulfide bonds (Ata S1a ma S2).Na matou faʻaalia le vaega faʻapitoa o le SPACA6 tagata (toega 27-246) i sela Drosophila S2 ma faʻamamaina le polotini e faʻaaoga ai le nickel affinity, cation exchange, ma le tele o le chromatography e le aofia ai (Fig. S1b).O le SPACA6 ectodomain mama e matua mautu ma tutusa.O su'esu'ega i le fa'aogaina o le tele o le chromatography fa'atasi ai ma le polygonal light scattering (SEC-MALS) na fa'aalia ai le tasi tumutumu ma le mamafa mole mole fuafuaina o le 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).E ogatasi lea ma le tele o le SPACA6 monomeric ectodomain, e faʻaalia ai e leʻi tupu le oligomerization i le taimi o le faʻamamaina.E le gata i lea, o le circular dichroism (CD) spectroscopy na faʻaalia ai se fausaga faʻafefiloi α / β faʻatasi ai ma se mea faʻafefeteina o le 51.3 °C (Fig. S1d,e).Deconvolution o le CD spectra faʻaalia 38.6% α-helical ma 15.8% β-stranded elemene (Ata S1d).
O le SPACA6 ectodomain na faʻapipiʻiina i le faʻaogaina o le matrix seeding38 e mafua ai se seti faʻamaumauga ma se iugafono o le 2.2 Å (Table 1 ma le Ata S3).O le fa'aogaina o le fa'aogaina o mole mole mole fa'avae vaega ma fa'amaumauga fa'asolosolo SAD fa'atasi ai ma le fa'aalia o le bromide mo le fa'atulagaina o le fa'atulagaga (Laulau 1 ma le Ata S4), o le fa'ata'ita'iga fa'amama mulimuli e aofia ai toega 27-246.I le taimi na faʻamautu ai le fausaga, e leai ni faʻataʻitaʻiga poʻo le AlphaFold fausaga na maua.Ole SPACA6 ectodomain e fua ile 20 Å × 20 Å × 85 Å, e aofia ai le fitu helices ma le iva β-strands, ma o loʻo i ai se gauga maualuga faʻalautele faʻamautu e ono disulfide bonds (Fig. 1a, b).O le vaivai eletise eletise i le pito o le Asn243 itu filifili o loʻo faʻaalia ai o lenei toega o se glycosylation fesoʻotaʻi-N.O le fausaga e aofia ai vaega e lua: o le N-terminal fa-helix bundle (4HB) ma le C-terminal Ig-like domain faʻatasi ai ma le vaeluagalemu o loʻo i le va o latou (Fig. 1c).
a Fa'atulagaga o le vaega extracellular domain o SPACA6.Aveese le ata o le vaega faaopoopo o le SPACA6, le lanu o le filifili mai le N i le C-mautu mai le lanumoana uliuli i le mumu pogisa.Cysteines o loʻo aʻafia i faʻamaufaʻailoga disulfide o loʻo faʻamaonia i le magenta.b Topology o le extracellular domain ole SPACA6.Fa'aaoga le lanu tutusa e pei o le Ata 1a.c SPACA6 vaega faaopoopo.O le 4HB, fa'amau, ma le Ig-pei o fa'ailoga vaega e valivali moli, lanu meamata, ma le lanumoana.E le tosoina ia fa'afanua i le fua.
O le 4HB domain o le SPACA6 e aofia ai faʻailoga autu e fa (helices 1-4), o loʻo faʻatulagaina i le tulaga o le helical helix (Fig. 2a), fesuiaʻi i le va o fesoʻotaʻiga faʻatasi ma fesoʻotaʻiga tutusa (Fig 2b).O se la'ititi la'ititi fa'aopoopo e tasi-liliu (helix 1′) o lo'o fa'ata'atia fa'asaga i le fusi, e fai ai se tafatolu ma le heliks 1 ma le 2. O lenei tafatolu o lo'o fa'aletonu teisi i le fa'apipi'i mimipiuta o le fa'apipi'i mafiafia o le helice 3 ma le 4 ( Ata 2a).
4HB N-terminal strip siata.b Va'aiga pito i luga o se fusi e fa helices, o helix ta'itasi o lo'o fa'amamafaina i le lanumoana pogisa i le N-terminus ma le lanu mumu i le C-terminus.c Ata uili li'o pito i luga i lalo mo le 4HB, fa'atasi ai ma toega ta'itasi o lo'o fa'aalia o se li'o ua fa'ailogaina ile mataitusi tasi le amino acid code;na o le fa amino acids i le pito i luga ole uili e faanumera.O toega e le o polar e lanu samasama, polar toega e le'i totogia e lanu meamata, o mea toega lelei e lanu lanumoana, ma mea e le lelei ona molia e lanu mumu.d O foliga tafatolu o le vaega 4HB, faatasi ai ma le 4HB i moli ma fa'amau i le lanu meamata.O mea fa'apipi'i uma e lua o lo'o fa'aalia ai fusi fa'a-disulfide fa'atusa.
O le 4HB o lo'o fa'atumauina i luga o le pito i totonu o le hydrophobic o lo'o fa'apipi'iina i toega aliphatic ma mea manogi (Ata 2c).O le totonugalemu o loʻo i ai se sootaga disulfide i le va o Cys41 ma le Cys55 e fesoʻotaʻi faʻatasi ai le helices 1 ma le 2 i se tafatolu maualuga maualuga (Fig. 2d).E lua isi faʻamaufaʻailoga disulfide na faʻapipiʻiina i le va o le CXXC motif i Helix 1 'ma le isi CXXC motif na maua i le pito o le β-hairpin i le itulagi faʻamau (Fig. 2d).O se toega arginine conservative ma se galuega e le iloa (Arg37) o loʻo i totonu o se tafatolu gaogao na fausia e helices 1', 1, ma le 2. Aliphatic carbon atoms Cβ, Cγ, ma Cδ Arg37 fegalegaleai ma le hydrophobic core, ma ona vaega guanidine cyclically gaoioi. i le va o helices 1' ma le 1 e ala i fegalegaleaiga i le va o le Thr32 ivi tua ma le filifili itu (Fig. S5a,b).Tyr34 fa'alautele i totonu o le ana ma tu'u ai ni pu laiti se lua e mafai ai e Arg37 ona fegalegaleai ma le solvent.
Ig-pei o le β-sandwich domains o se aiga sili tele o polotini e tutusa le uiga masani o le lua pe sili atu le tele-stranded amphipathic β-pepa e fegalegaleai e ala i le hydrophobic core 39. O le C-terminal Ig-like domain o SPACA6 e tutusa le mamanu. ma e aofia ai ni laulau se lua (Fig. S6a).Pepa 1 o se β-pepa o manoa e fa (anoa D, F, H, ma I) lea e fai ai fusi F, H, ma I se faatulagaga e tetee i le tutusa, ma fusi I ma D e faia se fegalegaleaiga tutusa.O le laulau 2 o se tama'i pepa fa'asaga fa'alua fa'alua fa'asaga (anoa E ma le G).O se faʻamaufaʻailoga disulfide i totonu na matauina i le va o le C-terminus o le filifili E ma le ogatotonu o le filifili H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).O lenei faʻamaufaʻailoga disulfide e tutusa ma le faʻamaufaʻailoga disulfide i le β-sandwich domain o immunoglobulin40,41.
O le fa-strand β-sheet mimilo i lona umi atoa, e fausia ai ni pito tutusa e eseese i foliga ma eletise.O le pito manifinifi ose mafolafola hydrophobic luga o le siosiomaga e tu i fafo pe a faatusatusa i le vaega o totoe le tutusa ma electrostatically eseese luga i SPACA6 (Fig. S6b,c).O lo'o si'osi'omia e se 'ele'ele le ivi pito i tua o vaega carbonyl/amino ma filifili pito polar luga ole vai (Fig. S6c).O le pito lautele o loʻo ufiufiina e se vaega faʻapipiʻi faʻapipiʻi e poloka ai le vaega N-terminal o le hydrophobic core ma fausia ai ni faʻamauga faʻamaʻi e tolu ma le vaega polar tatala o le ivi pito i tua F (Fig. S6d).O le vaega C-terminal o lenei pito e fai ai se taga tele ma se vaega o le hydrophobic autu.O le taga o loʻo siʻosiʻomia e moliaga lelei ona o seti e tolu o toega arginine faalua (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ma Arg212-Arg214) ma se histidine tutotonu (His220) (Ata S6e).
O le vaega faʻamau o se vaega pupuu i le va o le helical domain ma le Ig-like domain, e aofia ai le tasi antiparallel tolu-stranded β-layer (strands A, B ma C), o se laʻititi 310 helix, ma le tele o vaega faʻasolosolo umi.(Fig. S7).O se feso'ota'iga o feso'ota'iga covalent ma fa'aeletise i totonu o le vaega fa'amau e foliga mai e fa'amautu le fa'atonuga i le va o le 4HB ma le Ig-like domain.E mafai ona vaevaeina le fesoʻotaʻiga i ni vaega se tolu.O le vaega muamua e aofia ai le lua CXXC motifs (27CXXC30 ma 139CXXC142) lea e fausia ai se pea o fusi o le disulfide i le va o le β-hairpin i le hinge ma le 1' helix i le 4HB.O le vaega lona lua e aofia ai fesoʻotaʻiga eletise i le va o le Ig-like domain ma le faʻamau.Glu132 i totonu o le faʻamau e fausia ai se alalaupapa masima ma Arg233 i le Ig-like domain ma Arg135 i le faʻamau.O le vaega lona tolu o lo'o aofia ai se fa'amaufa'atasiga i le va o le Ig-pei o le vaega ma le fa'aitu.E lua fa'amauga disulfide (Cys124-Cys147 ma Cys128-Cys153) fa'afeso'ota'i le fa'amau fa'amau i se feso'ota'iga e fa'amautu e feso'ota'iga electrostatic i le va o le Gln131 ma le vaega fa'atino i tua, fa'atagaina le avanoa i le vaega muamua Ig-pei.filifili.
O le fausaga o le SPACA6 ectodomain ma fausaga taʻitasi o le 4HB ma le Ig-like domains na faʻaaogaina e suʻe ai faʻamaumauga tutusa tutusa i faʻamaumauga o porotini 42.Na matou fa'ailoaina fa'atusa ma togi maualuga a Dali Z, la'ititi la'ititi la'ititi, ma lapo'a LALI lapo'a (o le vaega mulimuli o le numera o toega fa'atusa tutusa).E ui o le 10 muamua na maua mai le suʻesuʻega atoa o le ectodomain (Table S1) sa i ai se Z-score e talia o> 842, o se sailiga mo le 4HB poʻo le Ig-like domain na o loʻo faʻaalia ai o le tele o nei mea e fetaui ma β-sandwiches.ose gauga i soo se mea e maua i le tele o polotini.O su'esu'ega uma e tolu i Dali na na'o le tasi le i'uga: IZUMO1.
Ua leva ona fautua mai o le SPACA6 ma le IZUMO1 e faʻasoa faʻatulagaga tutusa7,32,37.E ui o le ectodomains o nei palatini e lua e fesoʻotaʻi i le gamete e faʻasoa naʻo le 21% faʻasologa o faʻamatalaga (Ata S8a), faʻamaoniga faigata, e aofia ai le faʻasaoina o le faʻamaufaʻailogaina o le disulfide ma se vaʻaiga C-terminal Ig-like domain i SPACA6, faʻatagaina vave taumafaiga e fausia se fa'ata'ita'iga homology o A a SPACA6 isumu fa'aaoga IZUMO1 e fai ma fa'ata'ita'iga37.O la matou fausaga e faʻamaonia ai nei valoʻaga ma faʻaalia le tulaga moni o le tutusa.O le mea moni, o le SPACA6 ma le IZUMO137,43,44 fausaga faʻasoa tutusa le fausaga faʻapitoa e lua (Fig. S8b) faʻatasi ai ma 4HB ma Ig-like β-sandwich domains e fesoʻotaʻi i se itulagi faʻamau (Fig. S8c).
O le IZUMO1 ma le SPACA6 4HB o lo'o i ai eseesega masani mai fusi fa'asolo masani.4HBs masani, e pei oi latou o loʻo maua i totonu ole SNARE protein complexes o loʻo aʻafia i le endosomal fusion 45,46, o loʻo i ai le vaeluaga o le helices e faʻatumauina pea le curvature faifai pea i le ogatotonu o le axis 47. I se faʻatusatusaga, o le helical domains i le IZUMO1 ma le SPACA6 na faʻaseseina, faʻatasi ai ma curvature fesuisuiai ma fa'apipi'i lē tutusa (Ata S8d).O le mimilo, masalo e mafua mai i le tafatolu na faia e helices 1 ', 1 ma le 2, o loʻo taofia i le IZUMO1 ma le SPACA6 ma faʻamautu e le CXXC motif tutusa i luga o le helix 1'.Ae ui i lea, o le faʻaopoopoga o le disulfide bond o loʻo maua i le SPACA6 (Cys41 ma Cys55 faʻafesoʻotaʻi faʻatasi helices 1 ma le 2 i luga) e faʻatupuina ai se pito sili atu i le tafatolu pito i luga, ma sili atu ai le milo o le SPACA6 nai lo le IZUMO1, faʻatasi ai ma tafatolu pito sili ona taʻutaʻua.E le gata i lea, o le IZUMO1 e leai se Arg37 o loʻo matauina i le ogatotonu o lenei pu i SPACA6.I se faʻatusatusaga, o le IZUMO1 o loʻo i ai le sili atu o le hydrophobic autu o aliphatic ma mea manogi.
O le IZUMO1 o lo'o i ai le Ig-like domain e aofia ai le β-sheet43 fa'alua-lua ma lima-stranded.O le fa'asili fa'aopoopo i le IZUMO1 e sui ai le vili i le SPACA6, lea e fegalegaleai ma le F strand e fa'atapula'a ai le ivi pito i tua o le hydrogen i totonu o le manoa.O se mea manaia o le fa'atusatusaga o le va'aiga i luga o le va'aiga o vaega Ig-pei o polotini e lua.Ole luga ole IZUMO1 e sili atu ona leaga le molia nai lo le SPACA6 surface.O lo'o iai se totogi fa'aopoopo i tafatafa o le C-terminus fa'asaga i le sperm membrane.I le SPACA6, o itulagi lava e tasi na sili atu le le mautonu pe faʻamaonia lelei (Fig. S8e).Mo se faʻataʻitaʻiga, o le hydrophobic luga (mata sili ona manifinifi) ma lua faʻafefe lelei (mata lautele) i le SPACA6 o loʻo molia leaga ile IZUMO1.
E ui lava o le sootaga ma elemene fausaga lona lua i le va o le IZUMO1 ma le SPACA6 o loʻo faʻasaoina lelei, o le faʻaogaina o le faʻaogaina o le Ig-like domains na faʻaalia ai e eseese vaega e lua i la latou faʻasalalauga lautele e faʻatatau i le tasi ma le isi (Fig. S9).O le fusi faʻapipiʻi o le IZUMO1 o loʻo faʻafefeteina e uiga i le β-sandwich, faia le faʻamatalaga muamua o le "boomerang" i le tusa ma le 50 ° mai le ogatotonu tutotonu.I se faʻatusatusaga, o le faʻailoga helical i le SPACA6 na faʻafefeteina e uiga i le 10 ° i le isi itu.O le ese'esega i nei fa'atonuga e ono mafua ona o le 'ese'esega i le vaega fa'aisau.I le tulaga muamua o le faasologa, IZUMO1 ma SPACA6 faʻasoa faʻasologa tutusa i le faʻamau, sei vagana ai le cysteine, glycine, ma le aspartic acid residues.O le iʻuga, o faʻamauga hydrogen ma fesoʻotaʻiga eletise e matua ese lava.β-sheet elemene fausaga lona lua o loʻo faʻasoa e IZUMO1 ma SPACA6, e ui lava o filifili i le IZUMO1 e sili atu le umi ma le 310 helix (helix 5) e tulaga ese i le SPACA6.O nei eseesega e mafua ai le eseese o fa'asinomaga mo ni polotini tutusa e lua.
O la matou suʻesuʻega a le Dali na faʻaalia ai o le SPACA6 ma le IZUMO1 e naʻo le lua faʻataʻitaʻiga faʻatulagaina fausaga o loʻo teuina i totonu o le database database o loʻo i ai lenei 4HB fold (Table S1).Talu ai nei lava, DeepMind (Alphabet/Google) ua atiaʻe le AlphaFold, o se neural network based system e mafai ona vavalo saʻo le 3D fausaga o polotini mai faʻasologa muamua48.E leʻi umi talu ona matou foia le fausaga SPACA6, na faʻasaʻolotoina le AlphaFold database, ma tuʻuina atu faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga e aofia ai le 98.5% o polotini uma i le tagata proteome48,49.I le faʻaaogaina o la matou faʻatulagaina o le SPACA6 e fai ma faʻataʻitaʻiga suʻesuʻe, o se suʻesuʻega homology fausaga mo le faʻataʻitaʻiga i le AlphaFold human proteome na faʻamaonia ai sui tauva e mafai ona tutusa le fausaga ma SPACA6 ma IZUMO1.Tuuina atu le maoa'e o le sa'o atoatoa o le AlphaFold i le vavalo o le SPACA6 (Fig. S10a) -aemaise lava le 1.1 Å rms ectodomain pe a faʻatusatusa i le matou faʻatulagaina faʻamautu (Fig. S10b) -e mafai ona matou mautinoa o le SPACA6 faʻamaonia e foliga mai e saʻo.
I le taimi muamua, na suʻe ai e le PSI-BLAST le fuifui IZUMO1 ma isi polotini e tolu e fesoʻotaʻi i le sperm: IZUMO2, IZUMO3, ma le IZUMO450.Na valoia e le AlphaFold o nei polotini aiga IZUMO e gaugau i totonu o le 4HB domain faʻatasi ai ma le faʻasologa o le disulfide bond e pei o le IZUMO1 (Ata 3a ma le S11), e ui lava e leai se Ig-like domain.O loʻo faʻapea o le IZUMO2 ma le IZUMO3 e tasi le itu o le membrane proteins e tutusa ma le IZUMO1, ae o le IZUMO4 e foliga mai e lilo.O galuega a le IZUMO 2, 3, ma le 4 proteins i le gamete fusion e leʻi fuafuaina.O le IZUMO3 ua iloa e fai sona sao i le acrosome biogenesis i le taimi o le sperm development51 ma o le IZUMO protein ua maua e fausia ai se lavelave50.O le faʻasaoina o polotini IZUMO i mammals, reptiles, ma amphibians o loʻo fautua mai ai o latou gaioiga e mafai ona ogatusa ma isi mea faʻapitoa e fesoʻotaʻi ma gamete-fusion, e pei ole DCST1/2, SOF1, ma le FIMP.
Fa'ata'ita'iga o le fa'atagata o le IST superfamily, fa'atasi ai ma le 4HB, hinge, ma le Ig-pei o lo'o fa'amamafaina ile moli, lanumeamata, ma le lanumoana.IZUMO4 ei ai se itulagi C-terminal tulaga ese e foliga uliuli.O fa'amaufa'ailoga fa'amaonia ma fa'amaufa'ailoga o lo'o fa'aalia i laina malo ma togitogi.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM9), ma DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) o loʻo faʻaalia i le lanu tutusa e pei o le panel A. O faʻamaufaʻailoga disulfide o loʻo faʻaalia i le magenta.TMEM95, IZUMO2 ma IZUMO3 transmembrane helices e le o faʻaalia.
E le pei o le polotini IZUMO, o isi polotini SPACA (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ma SPACA9) e manatu e ese le faʻatulagaina mai le SPACA6 (Fig. S12).E na'o le SPACA9 e iai le 4HB, ae e le'o fa'amoemoeina e tutusa le fa'atusa-anti-parallel orientation po'o le fa'atasi o le disulfide e pei o le SPACA6.Na'o le SPACA1 o lo'o iai se vaega fa'atusa Ig.AlphaFold vavalo o SPACA3, SPACA4 ma SPACA5 e matua ese lava le fausaga nai lo SPACA6.O le mea e malie ai, o le SPACA4 ua lauiloa foi e fai se sao i le faʻamaʻiina, ae i se tulaga sili atu nai lo le SPACA6, nai lo le faʻafaigofieina o fegalegaleaiga i le va o le sperm ma le oocyte zona pellucida52.
O la matou su'esu'ega AlphaFold na maua ai se isi fetaui mo IZUMO1 ma SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, o se sperm-specific transmembrane protein, e faʻatamaʻi ai isumu tane pe a faʻaumatia 32,33.O le Spermatozoa e leai se TMEM95 sa i ai le morphology masani, motility, ma le mafai ona ulu i totonu o le zona pellucida ma fusifusia i le paʻu fuamoa, ae le mafai ona fusia ma le oocyte membrane.O suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai o le TMEM95 o loʻo faʻasoa faʻatusa tutusa ma le IZUMO133.O le mea moni, o le AlphaFold faʻataʻitaʻiga na faʻamaonia ai o le TMEM95 o se 4HB faʻatasi ai ma le paʻu tutusa o CXXC motifs e pei o IZUMO1 ma SPACA6 ma le faʻaopoopoga faʻaopoopoga o le disulfide i le va o le helices 1 ma le 2 o loʻo maua i le SPACA6 (Fig 3a ma le S11).E ui o le TMEM95 e leai se Ig-like domain, o loʻo i ai se itulagi faʻatasi ai ma se mamanu faʻapipiʻi disulfide e tutusa ma le SPACA6 ma IZUMO1 faʻamau faʻailoga (Fig. 3b).I le taimi o le lolomiina o lenei tusitusiga, na lipotia mai e le server preprint le fausaga o le TMEM95, faʻamaonia le AlphaFold53 iʻuga.TMEM95 e tutusa lelei ma SPACA6 ma IZUMO1 ma o loʻo faʻasaoina i le evolusione ua uma ona faʻaogaina i amphibians (Fig. 4 ma S13).
O le suʻesuʻega a le PSI-BLAST na faʻaogaina ai le NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ma SOF1 faʻamaumauga e fuafua ai le tulaga o nei faʻasologa i le laau o le ola.O le mamao i le va o pito lala e le o faʻaalia i le fua.
O le tulaga tutusa o le fausaga atoa i le va o le SPACA6 ma le IZUMO1 o loʻo taʻu mai ai o loʻo latou faʻavaeina sui o se aiga faʻasao faʻasao e aofia ai le TMEM95 ma le IZUMO 2, 3, ma le 4 proteins.tagata lauiloa: IZUMO1, SPACA6 ma TMEM95.Talu ai e na'o ni nai tagata o lo'o i ai le Ig-like domains, o le uiga iloga o le IST superfamily o le 4HB domain, lea e iai uiga fa'apitoa e masani ai i nei polotini uma: 1) Fa'apipi'i 4HB fa'atasi ma helices fa'atulagaina i se sui fa'afeagai/parallel (Fig). . 5a), 2) o le fusi o loʻo i ai se foliga tafatolu e aofia ai le lua helices i totonu o le fusi ma le lona tolu faʻasaga i luga (Fig. vaega autu (Fig. 5c) O le CXXC motif, o loʻo maua i thioredoxin-like proteins, ua iloa e galue. e pei o se redox sensor 54,55,56, ae o le mafuaaga i le IST tagata o le aiga e mafai ona fesootai ma isomerases disulfide porotini e pei o le ERp57 i gamete fusi.O matafaioi e fesootai 57,58.
O sui o le IST superfamily o loʻo faʻamatalaina e uiga faʻapitoa e tolu o le 4HB domain: fa helices e fesuiaʻi i le va o le tutusa ma le antiparallel orientation, ba-triangular helical bundle face, ma le ca CXXC motif lua na fausia i le va o molelaiti laiti.) N-terminal helixes (lanu moli) ma le fa'aisau itulagi β-hairpin (lanu meamata).
Tuuina atu le tutusa i le va o SPACA6 ma IZUMO1, o le gafatia o le muamua e fusifusia i IZUMO1 poʻo JUNO na tofotofoina.Biolayer interferometry (BLI) o se auala faʻapipiʻi faʻavae kinetic lea na faʻaaogaina muamua e faʻatusatusa ai le fegalegaleaiga i le va o IZUMO1 ma JUNO.Ina ua maeʻa le faʻaogaina o le biotin-label sensor ma le IZUMO1 e pei o se maunu ma se maualuga maualuga o le JUNO analyte, na iloa ai se faailo malosi (Fig. S14a), e faʻaalia ai se suiga faʻapipiʻiina i le mafiafia o le biomaterial faʻapipiʻi i le pito o le sensor.Faailoga tutusa (ie, JUNO faʻapipiʻi i le masini e fai ma maunu e faasaga i le IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).E leai se fa'ailoga na iloa ina ua fa'aogaina le SPACA6 e fai ma au'ili'ili e fa'asaga i le IZUMO1 po'o le JUNO fa'amaufa'ailogaina (Ata S14a,b).O le leai o lenei faʻailoga e faʻaalia ai o le extracellular domain o SPACA6 e le fegalegaleai ma le extracellular domain o IZUMO1 poʻo JUNO.
Talu ai ona o le BLI assay e faʻavae i luga o le biotinylation o toega lysine saoloto i luga o le porotini maunu, o lenei suiga e mafai ona taofia le fusifusia pe afai o loʻo aʻafia ai le lysine i le fegalegaleaiga.E le gata i lea, o le faʻaogaina o le fusifusia e fesoʻotaʻi ma le masini e mafai ona faʻalavelave faʻalavelave, o lea na faia ai suʻega toso-lalo masani i luga ole SPACA6, IZUMO1 ma JUNO ectodomains.E ui lava i lea, e leʻi faʻafefeteina e le SPACA6 le IZUMO1 poʻo le JUNO (Fig. S14c, d), e faʻaalia ai le leai o se fegalegaleaiga e tutusa ma le mea na matauina i suʻesuʻega BLI.I le avea ai o se faʻatonuga lelei, na matou faʻamaonia le fegalegaleaiga a JUNO ma faʻailogaina Lana IZUMO1 (Ata S14e ma S15).
E ui i le tutusa o le fausaga i le va o le SPACA6 ma le IZUMO1, o le le mafaia e SPACA6 ona fusifusia JUNO e le o se mea e ofo ai.O luga o le tagata IZUMO1 e sili atu nai lo le 20 toega o loʻo fegalegaleai ma JUNO, e aofia ai toega mai itulagi taʻitasi e tolu (e ui lava o le tele oi latou o loʻo i totonu o le faʻailoga) (Fig. S14f).Mai nei toega, e na'o le tasi e fa'asaoina ile SPACA6 (Glu70).E ui o le tele o mea na totoe na fa'atumauina a latou mea totino fa'aola, o le Arg160 toega taua i le IZUMO1 na suia e le Asp148 fa'aletonu i le SPACA6;suʻesuʻega talu ai ua faʻaalia o le suiga o Arg160Glu i le IZUMO1 toetoe lava a faʻaumatia atoa le fusia i JUNO43.E le gata i lea, o le eseesega i le faʻasalalauga i le va o le IZUMO1 ma le SPACA6 na matua faʻapupulaina ai le vaega o le JUNO-binding site o le itulagi tutusa ile SPACA6 (Fig. S14g).
E ui lava i le manaʻoga faʻapitoa mo SPACA6 mo le fusuaga gamete ma lona tutusa ma le IZUMO1, SPACA6 e foliga mai e leai se galuega faʻatusa tutusa JUNO.O le mea lea, ua matou taumafai e tuʻufaʻatasia a matou faʻamaumauga faʻamaumauga ma faʻamaoniga o le taua na saunia e le evolusione biology.O le fa'asologa o le fa'asologa o le SPACA6 homologues o lo'o fa'aalia ai le fa'asaoina o le fausaga masani i tua atu o mammals.Mo se faʻataʻitaʻiga, o totoe o le cysteine ​​o loʻo i ai e oʻo lava i amphibians e fesoʻotaʻi mamao (Ata 6a).I le faʻaaogaina o le ConSurf server, tele faʻasologa faʻasologa o faʻamaumauga o le 66 faʻasologa na faʻafanua i luga ole SPACA6 surface.O lenei ituaiga o au'ili'iliga e mafai ona fa'aalia ai po'o fea toega na fa'asaoina i le taimi o le evolusione polotini ma e mafai ona fa'ailoa mai po'o fea vaega i luga ole laiga e iai sona sao i galuega.
se Fa'asologa fa'asologa o SPACA6 ectodomains mai le 12 ituaiga eseese na saunia e fa'aoga CLUSTAL OMEGA.E tusa ai ma le suʻesuʻega a le ConSurf, o tulaga sili ona le mautonu e faʻailogaina i le lanumoana.O totoe o le Cysteine ​​e faʻamaonia i le mumu.O tuaoi o le fanua ma elemene fausaga lona lua o loʻo faʻaalia i le pito i luga o le faʻaogaina, lea e faʻaalia ai e aū β-strands ma galu e faʻaalia ai helices.O le NCBI Access Identifiers o loʻo i ai faʻasologa o mea nei: tagata (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), manuki capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), solofanua (Equus wharcophae, XP_011821277) 3 XP_032_034) .), mamoe (Ovis aries, XP_014955560), elefane (Loxodonta africana, XP_010585293), taʻifau (Canis lupus familyis, XP_025277208), isumu (Mus musculus, NP_001156381), Tascophilus _06381), Tascophilus_0381, Tascophilus_0381, Tascophilus_038100000000 ypus, 8) , 61_89 ma Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).O le fa'anumeraina e fa'atatau i le fa'atonuga a tagata.b Fa'atusa mata o le fausaga SPACA6 ma le 4HB i le pito i luga ma le Ig-pei o le vaega i le pito i lalo, lanu e fa'atatau i fua fa'asao mai le ConSurf server.O vaega sili ona lelei e fa'asaoina e lanu moana, o vaega fa'asao lelei o lo'o i le papa'e, a'o mea e sili ona fa'asao e lanu samasama.cystine lanu viole.E tolu fa'ailoga pito i luga e fa'aalia ai le maualuga o le puipuiga o lo'o fa'aalia i totonu o fa'ailoga fa'ailoga 1, 2 ma le 3. O lo'o fa'aalia se ata 4HB i le fa'aofi i le pito i luga taumatau (tulaga lanu tutusa).
O le fausaga o le SPACA6 e tolu vaega sili ona fa'asaoina i luga o le eleele (Ata 6b).O le Patch 1 e o'o atu i le 4HB ma le vaega fa'aisau ma o lo'o i ai ni alalaupapa CXXC disulfide fa'asao e lua, o le Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 feso'ota'iga (Fig. S7), ma le tolu fa'asao mea manogi manogi (Phe31, Tyr73, Phe137)).ose au'ai lautele o le vaega Ig-pei (Fig. S6e), o lo'o fa'atusalia ai le tele o toega lelei i luga o le sperm surface.O le mea e malie ai, o lenei patch o loʻo i ai se epitope antibody lea na faʻaalia muamua e faʻalavelave i le SPACA6 30 galuega.Itulagi 3 o loʻo faʻasalalau le faʻamau ma le tasi itu o le Ig-like domain;o lenei itulagi o lo'o i ai fa'apolopolo fa'asao (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ma fa'asaga i fafo polar/toega tau.O le mea e ofo ai, o le tele o toega i luga o le 4HB e matua fesuisuiai (Fig. 6b), e ui lava o le lafu e faʻasaoina i le SPACA6 homologue (e pei ona faʻaalia e le conservatism o le hydrophobic bundle core) ma tua atu o le IST superfamily.
E ui lava o le vaega pito i laʻititi lea i le SPACA6 ma le itiiti ifo o elemene fausaga lua e mafai ona iloa, o le tele o toega o le itulagi (e aofia ai le itulagi 3) e matua faʻasaoina i totonu o SPACA6 homologues, lea e mafai ona faʻaalia ai o le faʻaogaina o le fusi faʻatasi ma le β-sandwich e iai sona sao.e pei o se conservative.Ae ui i lea, e ui lava i le tele o fesoʻotaʻiga o le hydrogen ma fesoʻotaʻiga eletise i le itulagi o SPACA6 ma IZUMO1, o faʻamaoniga o le fetuutuunai faʻapitoa e mafai ona vaaia i le faʻaogaina o le tele o fausaga faʻatagaina o IZUMO137,43,44.O le faʻaogaina o vaega taʻitasi na faʻapipiʻiina lelei, ae o le faʻaogaina o faʻasalalauga e fesoʻotaʻi ma isi e eseese mai le 50 ° i le 70 ° mai le axis tutotonu (Fig. S16).Ina ia malamalama i le faʻaogaina o le SPACA6 i le fofo, sa faia suʻega SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio toe fausia o le SPACA6 ectodomain e ogatusa ma se fausaga tioata tootoo (Fig. S18), e ui o le Kratky plot na faaalia ai sina tikeri o le fetuutuunai (Fig. S17b).O le fa'atusa lea e fa'afeagai ma le IZUMO1, lea o lo'o fa'apea ai le polotini e le'i fa'amauina e fa'afoliga boomerang i le lattice ma le solution43.
Ina ia faʻamaonia faʻapitoa le itulagi fetuutuunai, hydrogen-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) na faia ile SPACA6 ma faʻatusatusa i faʻamaumauga na maua muamua ile IZUMO143 (Fig. 7a,b).O le SPACA6 e manino lava e sili atu ona fetuutuunai nai lo IZUMO1, e pei ona faʻamaonia e le maualuga o le deuterium fesuiaiga i totonu o le fausaga pe a uma le 100,000 s o fefaʻatauaiga.I totonu o fausaga uma e lua, o le vaega C-terminal o le faʻailoga o loʻo faʻaalia ai le maualuga o le fesuiaiga, atonu e mafai ai ona faʻatapulaʻaina le suiga o le 4HB ma le Ig-like domains e fesoʻotaʻi ma isi.O le mea e malie ai, o le vaega C-terminal o le SPACA6 hinge, e aofia ai le 147CDLPLDCP154 toega, o se vaega sili ona faʻasaoina 3 (Fig. 6b), atonu e faʻaalia ai o le fetuutuunai o le interdomain o se vaega faʻaleleia evolutionarily o SPACA6.E tusa ai ma le suʻesuʻega fetuutuunai, o faʻamaumauga faʻafefeteina CD na faʻaalia ai o le SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) e itiiti ifo le mautu nai lo IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e ma S19).
a H-DXMS ata o SPACA6 ma b IZUMO1.Ole pasene ole fesuiaiga ole deuterium na fa'amauina ile taimi fa'ailoa.Ole maualuga ole fesuiaiga ole hydrogen-deuterium o lo'o fa'aalia ile lanu ile fua fa'agasolo mai le lanumoana (10%) ile mumu (90%).Pusa uliuli e fai ma sui o vaega o fefaʻatauaʻiga maualuga.O tuaoi o le 4HB, hinge ma le Ig-like domain o loʻo matauina i le fausaga tioata o loʻo faʻaalia i luga aʻe o le faasologa muamua.Deuterium fa'afesuia'i tulaga i 10 s, 1000 s, ma 100,000 s sa fa'ata'oto i luga o se siata fa'apipi'i i luga o le mole mole manino o SPACA6 ma IZUMO1.O vaega o fausaga o lo'o iai le maualuga o le fesuiaiga o le deuterium i lalo ole 50% e lanu pa'epa'e.O vaega i luga a'e o le 50% H-DXMS fefa'ataua'iga o lo'o valivali i se fua fa'alili.
O le fa'aogaina o le CRISPR/Cas9 ma le mouse gene knockout genetic strategies ua ta'ita'ia ai le fa'ailoaina o le tele o mea taua mo le fusifusia o le sperm ma le fuamoa ma le fusi.E ese mai i fegalegaleaiga lelei o le IZUMO1-JUNO ma le CD9 fausaga, o le tele o polotini e fesoʻotaʻi ma le gamete fusion e tumau pea le faʻatulagaina ma le faʻatinoina o galuega.O le biophysical ma le faʻatulagaina o le SPACA6 o se isi vaega o le paso mole mole adhesion / fusion i le taimi o le faʻamaʻiina.
SPACA6 ma isi sui o le IST superfamily e foliga mai e matua fa'asaoina i mammals fa'apea fo'i manu felelei ta'itasi, reptile, ma amphibians;o le mea moni, e manatu e manaʻomia le SPACA6 mo le faʻamaʻiina i le zebrafish 59. O lenei tufatufaga e tutusa ma isi polotini e fesoʻotaʻi faʻatasi gamete e pei ole DCST134, DCST234, FIMP31, ma le SOF132, o loʻo fautua mai ai o nei mea e le HAP2-le atoatoa (faʻapea foʻi). ua ta'ua o le GCS1) polotini e nafa ma le gaioiga fa'ata'ita'i a le tele o protist., laau, ma arthropods.Fertilized fusion proteins 60, 61. E ui lava i le malosi o le faʻatulagaga tutusa i le va o le SPACA6 ma le IZUMO1, o le tuʻituʻi o kenera e faʻapipiʻi ai soʻo se tasi o nei polotini na mafua ai le leai o se tamaititi i tamaʻi isumu, e faʻaalia ai e le o faʻaluaina a latou galuega i le gamete fusion..I se tulaga lautele, e leai se tasi o polotini sperm ua iloa e mana'omia mo le vaega pipii o le fusu'aga e le toe fa'aaogaina.
O lo'o tumau pea se fesili matala pe o le SPACA6 (ma isi sui o le IST superfamily) e auai i feso'ota'iga va'ava'ai, fausia feso'ota'iga intragametic e su'e ai polotini taua i mea fa'afefiloi, pe atonu fo'i e fai o ni fusogens fa'aletonu.Co-immunoprecipitation suʻesuʻega i sela HEK293T na faʻaalia ai se fegalegaleaiga i le va o le umi atoa IZUMO1 ma SPACA632.Ae ui i lea, o matou ectodomains recombinant e leʻi fegalegaleai i vitro, ma fautua mai o fegalegaleaiga o loʻo vaaia i Noda et al.na faʻaumatia uma i totonu o le fausiaina (maitau le siʻusiʻu cytoplasmic o IZUMO1, lea ua faʻaalia e le manaʻomia mo le faʻamaʻiina62).I le isi itu, IZUMO1 ma/poʻo le SPACA6 atonu e manaʻomia ni siosiomaga faʻapitoa faʻapitoa tatou te le toe gaosia i totonu o le vitro, e pei o faʻasologa faʻapitoa o le physiologically poʻo faʻalavelave mole o loʻo iai isi polotini (e iloa pe leʻi mauaina).E ui lava o le IZUMO1 ectodomain e talitonuina e faʻafesoʻotaʻi le faʻapipiʻiina o le spermatozoa i le fuamoa i le perivitelline space, e le o manino le faʻamoemoe o le SPACA6 ectodomain.
O le fausaga o le SPACA6 o loʻo faʻaalia ai le tele o mea faʻasao e mafai ona aʻafia i fegalegaleaiga protein-protein.O le vaega fa'asao o le vaega fa'amau e lata ane i le CXXC motif (fa'ailoga Patch 1 i luga) o lo'o i ai le tele o mea manogi e fa'asaga i fafo e masani ona feso'ota'i ma feso'ota'iga hydrophobic ma π-stacking i le va o biomolecules.O itu lautele o le Ig-like domain (itulagi 2) e fausia ai se togafiti faʻamalosia lelei ma le faʻasaoina o Arg ma Ona toega, ma o mea faʻamaʻi e faasaga i lenei itulagi na faʻaaogaina muamua e poloka ai le fusi o le gamete 30.E iloa e le antibody le laina laina epitope 212RIRPAQLTHRGTFS225, lea e tolu o le ono arginine toega ma sili ona faasaoina His220.E le o manino pe o le faaletonu e mafua ona o le poloka o nei toega patino poʻo le itulagi atoa.O le nofoaga o lenei va i tafatafa o le C-terminus o le β-sandwich o loʻo faʻaalia ai fesoʻotaʻiga cis ma palatini sperm lata ane, ae le o proteins oocyte.E le gata i lea, o le taofiofia o se mea e sili ona fetuutuunai ma le tele o le proline-rich tangle (site 3) i totonu o le faʻamau e mafai ona avea ma nofoaga o se fegalegaleaiga protein-protein poʻo, e foliga mai, e faʻaalia ai le taofiofia o le fetuutuunai i le va o vaega e lua.E taua le itupa mo le matafaioi le iloa ole SPACA6.fusuaga o gametes.
SPACA6 o loʻo i ai meatotino o polotini adhesion intercellular, e aofia ai Ig-pei β-sandwiches.O le tele o polotini pipii (fa'ata'ita'iga, cadherins, integrins, adhesins, ma IZUMO1) o lo'o i ai se tasi po'o le sili atu β-sandwich domains e fa'alautele atu ai polotini mai le sela sela i o latou si'osi'omaga sini63,64,65.O le vaega Ig-pei o le SPACA6 o loʻo iai foʻi se mafuaʻaga e masani ona maua i β-sandwiches o le pipii ma le faʻatasi: faʻaluaina o laina tutusa i pito o β-sandwiches, e taʻua o masini masini66.E talitonuina o lenei mafuaʻaga e faʻateleina ai le teteʻe atu i malosi faʻafefe, lea e taua mo polotini o loʻo aʻafia i fegalegaleaiga intercellular.Ae ui i lea, e ui lava i lenei mea e tutusa ma adhesins, e leai se faʻamaoniga o le SPACA6 e fegalegaleai ma fuamoa fuamoa.O le SPACA6 ectodomain e le mafai ona fusifusia i JUNO, ma SPACA6-faʻaalia HEK293T sela, e pei ona faʻaalia iinei, e faigata ona fegalegaleai ma oocytes e leai se zona 32.Afai e fa'atūina e le SPACA6 so'otaga va'ava'ai, e mana'omia e nei feso'ota'iga ni suiga pe a mae'a fa'aliliuga po'o le fa'amautuina e isi polotini sperm.I le lagolagoina o le manatu mulimuli, o le IZUMO1-deficient spermatozoa e fusifusia i oocytes, e faʻaalia ai o molelaʻau e ese mai i le IZUMO1 o loʻo aʻafia i le laʻasaga o le gamete adhesion 27.
O le tele o viral, cellular, and developmental fusion proteins ei ai mea totino e valoia ai a latou galuega o fusogens.Mo se faʻataʻitaʻiga, viral fusion glycoproteins (vasega I, II ma III) o loʻo i ai le hydrophobic fusi peptide poʻo le matasele i le pito o le porotini o loʻo tuʻuina i totonu o le membrane talimalo.O le faʻafanua o le hydrophilicity o le IZUMO143 ma le fausaga (faʻamoemoeina ma valoia) o le IST superfamily na faʻaalia ai le leai o se peptide fusion hydrophobic.O lea la, afai ei ai ni polotini i le IST superfamily e galue e pei o fusogens, latou te faia i se auala e ese mai isi faʻataʻitaʻiga masani.
I le faaiuga, o galuega a sui o le IST superfamily o polotini e fesoʻotaʻi ma le gamete fusion e tumau pea o se mealilo mataʻutia.O la matou mole faʻafouina SPACA6 ma lona faʻatulagaina o le a maua ai le faʻamalamalamaga i sootaga i le va o nei fausaga faʻasoa ma la latou matafaioi i le faʻapipiʻiina o le gamete ma le fusi.
O le faʻasologa o DNA e fetaui ma le SPACA6 ectodomain tagata (NCBI numera o le NP_001303901.1; toega 27-246) na faʻaogaina le codon-optimized mo faʻamatalaga i le Drosophila melanogaster S2 sela ma faʻapipiʻiina e avea o se vaega o le gene ma le faʻasologa o le Kozak (Eurofins Genomics)., o le faailo o le fa'alilolilo o le BiP ma le 5 'ma le 3' fa'ai'uga mo le fa'amuta-tuto'atasi tuto'atasi o lenei ga'o i totonu o se ve'a fa'aaliga pMT e fa'avae i luga o se fa'alauiloa metallothionein ua fa'aleleia mo le filifilia ma puromycin (pMT-puro).O le pMT-puro vector e faʻapipiʻiina se nofoaga o le thrombin cleavage sosoo ai ma le 10x-His C-terminal tag (Ata S2).
O le felauaiga mautu o le SPACA6 pMT-puro vector i totonu D. melanogaster S2 (Gibco) sela na faia tutusa ma le protocol na faʻaaogaina mo IZUMO1 ma JUNO43.O sela S2 na fa'afefeteina ma fa'atupuina i le Schneider's medium (Gibco) fa'aopoopoina i le fa'amauina fa'ai'uga o le 10% (v/v) le vevela o le fetal calf serum (Gibco) ma le 1X antimycotic antibiotic (Gibco).O sela muamua (3.0 x 106 sela) na faʻapipiʻiina i vaieli taʻitasi o papatusi 6-vai (Corning).Ina ua maeʻa le 24 itula o le incubation i le 27 ° C, na faʻafeiloaʻi sela i se faʻafefiloi o le 2 mg o le SPACA6 pMT-puro vector ma le Effectene transfection reagent (Qiagen) e tusa ai ma le faʻasologa o le gaosiga.O sela faʻafefe na faʻapipiʻiina mo le 72 itula ona seleseleina lea ma le 6 mg / ml puromycin.Ona vavae ese lea o sela mai le auala atoa a Schneider ma tuu i totonu ole serum free Insect-XPRESS medium (Lonza) mo le gaosiga o polotini tetele.O le 1 L vaega o le S2 aganuʻu na tupu aʻe i le 8-10 × 106 ml-1 sela i totonu o le 2 L ventilated flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer flask ona faʻamaʻaina lea ma se faʻamaʻi mulimuli o le 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ma faʻamaʻi mama.fa'aoso.O aganuʻu faʻaosoina na faʻapipiʻiina i le 27 ° C. i le 120 rpm mo aso e fa.
O lo'o iai le SPACA6 o lo'o tu'u'ese'ese e ala ile centrifugation ile 5660×g ile 4°C ona soso'o ai lea ma le Centramate tangential flow filtration system (Pall Corp) ma le 10 kDa MWCO membrane.Fa'aaogā le fa'aputuga o lo'o iai le SPACA6 ile koluma 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen).Na fufulu le resin Ni-NTA i le 10 koluma voluma (CV) o le paʻu A ona faʻaopoopoina lea o le 1 CV o le paʻu A e tuʻuina atu ai le faʻamaʻi mulimuli o le imidazole o le 50 mM.O le SPACA6 na faʻaaogaina i le 10 ml o le paʻu A faʻaopoopoina i le imidazole i se faʻasalaga mulimuli o le 500 mM.Fa'asa'o vasega thrombin (Millipore Sigma) na fa'aopoopo sa'o i le fa'amama toto (MWCO 12-14 kDa) i le 1 iunite i le mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ma le 150 mM NaCl (buffer B) mo le fa'amama toto.) ile 4°C mo le 48 itula.O le SPACA6 ua fa'a'ele'elea thrombin na fa'afefeteina fa'atolu e fa'aitiitia ai le masima ma tu'u i luga o le 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange column (Cytiva/GE) fa'atasi ma le 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.O le cation exchanger na fufuluina i le 3 CV o 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ona faʻafefe ai lea o le SPACA6 ma le laina laina o le 0 i le 500 mM NaCl i le 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 mo le 25 CV.Ina ua maeʻa le chromatography fesuiaiga o ion, na faʻapipiʻi le SPACA6 i le 1 ml ma faʻapipiʻi isocratically mai se ENrich SEC650 10 x 300 koluma (BioRad) faʻatasi ma le paʻu B. E tusa ai ma le chromatogram, vaitaele ma faʻamaʻi vaega vaega o loʻo iai SPACA6.O le mama na pulea e Coomassie-stained electrophoresis i luga ole 16% SDS-polyacrylamide gel.O le faʻaogaina o porotini na faʻatatauina e ala i le faʻaogaina i le 280 nm e faʻaaoga ai le tulafono Beer-Lambert ma le faʻaogaina o le molar faʻatasi.
O le SPACA6 ua fa'amamāina na fa'amama i le po e fa'asaga i le 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 ma le 150 mM NaF ma fa'afefiloi i le 0.16 mg/mL a'o le'i su'esu'eina e le CD spectroscopy.O suʻesuʻega faʻapitoa o CD ma le umi o le galu o le 185 i le 260 nm na aoina i luga o le Jasco J-1500 spectropolarimeter e faʻaaoga ai le quartz cuvettes ma le 1 mm le umi o le auala (Helma) i le 25 ° C i le fua o le 50 nm / min.O le CD spectra sa fa'asa'o le laina fa'avae, averesi i luga ole 10 mauaina, ma fa'aliliu i lona uiga o totoe ellipticity (θMRE) i tikeri cm2/dmol:
o le MW o le mamafa mole mole o fa'ata'ita'iga ta'itasi i Da;N o le numera o amino acids;θ o le ellipticity i milidegree;d e fetaui ma le umi o le ala opitika i cm;fa'amauina o porotini i iunite.