310 10*1mm Uamea uamea coiled tubing vaega vailaʻau, O le N-terminal domains o spidroin fausia hydrogels e faavae i fibrils amyloid ma saunia se tulaga mo le immobilization porotini.

Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O lo'o e fa'aogaina se su'esu'ega e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).E le gata i lea, ina ia mautinoa le lagolago faifaipea, matou te faʻaalia le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Fa'ase'e o lo'o fa'aalia tala e tolu ile fa'ata.Fa'aoga le pito i tua ma le isi ki e fa'asolo ai fa'ase'e, po'o fa'amau fa'ase'e i le pito e fa'asolo ai fa'ase'e ta'itasi.

Fa'amatalaga

310 10*1mm Fa'atau paipa vili uamea uamea

Fa'asu'esu'ega o vaila'au

Meatotino Fa'ainisinia

O polotini siliki apogaleveleve toe tu'ufa'atasia (protein siliki spider) e tele mea e mafai ona fa'aogaina i le atina'eina o mea olaola fou, ae o lo latou natura multimodal ma aggregation-prone e faigata ai ona maua ma faigofie ona fa'aoga.O iinei matou te lipoti atu ai o polotini spidroin toe tuʻufaʻatasia ma, o le mea taua, o le N-terminal domain (NT) lava ia e vave ona fausia ni hydrogels lagolago ma manino i le 37 °C.polotini fusi e aofia ai le NT ma le lanumeamata felanulanua'i polotini po'o le purine nucleoside phosphorylase e fau ai polotini fusuaga atoatoa.Hydrogels.O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai o le NT recombinant ma le fusi faʻatasi e maua ai faʻamatalaga maualuga ma maua ai hydrogels ma mea matagofie e pei o le manino, gelation e aunoa ma le faʻafesoʻotaʻi, ma le faʻaogaina saʻo o polotini malosi i le maualuga maualuga.
O apogaleveleve e tusa ma le fitu seti eseese o mata siliki, e tofu ma le ituaiga siliki.O ituaiga siliki uma e fitu e aofia ai polotini silika apogaleveleve (spidroins) e tusa ma le 6000 toega umi ma o loʻo i ai se vaega tele toe fai totonugalemu o loʻo siʻosiʻomia e le N- ma C-terminal domains (NT ma CT)1,2.O le ituaiga siliki e sili ona suʻesuʻeina, o le ampulla muamua, e gaosia e le gland ampulla muamua.I totonu o lenei gland, o se monolayer o sela epithelial synthesizes spidroin proteins ma natia i latou i le lumen o le gland, lea o loʻo i ai i se faiga soluble (doping) i maualuga maualuga concentrations (30-50% w / v)3,4.O le faʻatulagaina ma le faʻatulagaina o polotini spidroin ampullar autu i totonu o le gland ua finauina, ae o le tele o faʻamaoniga faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia ai le i ai o se faʻasologa masani o le helical ma / poʻo le faʻalavelave faʻafuaseʻi ma le micellar poʻo le lamellar structures5,6,7,8,9,10.Aʻo faʻatonuina e le vaega faʻasolosolo mea faʻainisinia o filo silika, fausia β-pepa nanocrystals ma amorphous structures11,12,13,14,15, pito pito i tua e faʻatonutonu alava siliki i le tali atu i suiga suiga i luga o le siliki gland16,17,18.E ala i le fa'atonutonuina o le fa'atupu silika, 19. O lo'o fa'asao fa'aolaolaina nofoaga fa'aumu ma o latou galuega e mafai ona masani i polotini spidroin uma 2,20,21.I le taimi e ui atu ai i le gland, o le pH o le spidroin e faʻaitiitia mai le tusa ma le 7.6 i le <5.716 ma faʻateleina i le sele ma le faʻalauteleina e ala i le fegasoloaʻi e ala i le vaʻa faasolosolo malie.I le fofo, o le CT o se α-helical constitutive parallel dimer17, ae i le tali atu i le maualalo o le pH ma le malosi o le shear, CT e tatala ma fesuiai β-layers16, 17, atonu e faʻaosoina β-layers i itulagi toe fai o le Convert 16. NT e monomeric i lalo. tulaga e atagia ai tulaga i totonu o le lumen o le gland ma faʻatalanoaina le solubility o le spidroin, ae i le faʻaitiitia o le pH, o le protonation o le tele o filifili itu o le carboxylic acid e taʻitaʻia ai le dimerization o le NT ma le pKa e tusa ma le 6.5, ma faʻamautu ai le NT ma faʻapipiʻi spidroin i le tele. aofaiga.feso'ota'iga16,18.O le mea lea, o le NT o loʻo i ai se sao taua i le faʻavaeina o filament, suia mai le monomer i le faʻapipiʻiina i le dimer i le fiber23,24,25.NT tumau maualuga soluble ma helical i lalo o tulaga uma suʻesuʻeina i aso16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, lea na musuia ai lona atinaʻe e avea o se faʻailoga e faʻaleleia ai le solubility mo le gaosiga o polotini heterologous.
Recombinant mini apogaleveleve silika polotini, e aofia ai le tasi NT, tasi le vaega toe fai puupuu, tasi le CT, ma le His6 tag (His-NT2RepCT) mo le faamamaina, e soluble i le vai paʻu e pei ole polotini silika apogaleveleve masani ma faʻatusa uiga taua o le apogaleveleve silika. .fa'asalalauga 25.31.O lana-NT2RepCT e mafai ona milo i filo faʻaauau e faʻaaoga ai se masini biomimetic lea e faʻapipiʻiina ai le pH 8 soluble coating i totonu o le pH 525,32,33,34,35 vai taele.Bioreactor fermentation o E. coli faʻaalia Lana-NT2RepCT ma mulimuli ane togafitiga na maua ai le> 14 g / L fua pe a uma ona faʻamamaina.Ole maualuga ole fua, maualuga ole solubility, ma le tali lelei ole His-NT2RepCT ile acidic condition e mafua uma ile NT23,25,34.
O iinei matou te lipotia ai le vave fausia o hydrogels manino mai polotini spidroin recombinant, e aofia ai le NT na o ia, e ala i le incubating o se vaifofo porotini i le 37 °C.I le faʻaaogaina o le thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) ma le transmission electron microscopy (TEM), na matou iloa ai o le NT ma le microspider proteins e faia suiga faʻavae i β-pepe ma fibrils pei o le amyloid. pe a fai gels.E le gata i lea, o polotini fusuaga o le NT ma le polotini fluorescent lanu meamata (GFP) po'o le purine nucleoside phosphorylase (PNP) e fausia ai hydrogels faatasi ai ma ni vaega fusuaga atoatoa.Fa'amatalaga maualuga i totonu o 'au heterologous, fa'atasi ai ma le vave fa'avaeina o hydrogels i lalo o tulaga fa'aletino, e matala ai le avanoa e maua ai le taugofie o le gaosiga o hydrogels ma galuega fa'ainisinia.
E le pei o le tele o lipoti recombinant spidroin proteins36, o le His-NT2RepCT e mautu i le Tris-HCl buffer i le pH 8 ma e mafai ona faʻapipiʻi i le 500 mg/mL e aunoa ma se timuga25.O le mea lea, na matou ofo ai i le mauaina o lenei porotini e vave ona fausia opitika manino, e lagolagoina e le tagata lava ia hydrogels pe a incubated i le 37°C (Fig. 1b-d).O isi suʻesuʻega na faʻaalia ai o le His-NT2RepCT gelation na tupu i luga o le tele o faʻasologa o porotini (10-300 mg / mL) ma o lenei faʻatonuga na faʻafeiloaʻi faʻatasi ma le taimi faʻafefe (Fig. 1c ma le Faʻaopoopo Fig. 1).Ina ia suʻesuʻeina po o fea vaega o le His-NT2RepCT e faʻatautaia le faʻavaeina o le hydrogel, ona matou suʻesuʻeina lea o vaega taʻitasi ma i tuʻufaʻatasiga eseese e faʻaaoga ai se suʻega faʻafefe (Ata 1a,b).O vaega uma na fa'ata'ita'iina o le spidroin recombinant na faia ni gels (i le fa'apolotini o le 300 mg/mL) i lalo ifo o le 1 h, se'i vagana ai le 2Rep ua fa'atupuina (Fig. 1b).O loʻo taʻu mai ai o le NT ma le CT naʻo, faʻatasi, pe fesoʻotaʻi ma toe fai, e mafai ona gel i le 37 ° C ma o le His6 tag e le afaina ai lenei faagasologa i soʻo se tulaga taua.Ona o le manatu masani e faapea o le NT o se polotini e sili ona soluble ma mautu, ma o lipoti talu ai o recombinant spidroin hydrogels ua mafua ai aafiaga gelation i suiga o le conformational i itulagi toe fai ma / poo CTs, NT lava ia e mafai.O le mauaina o le gelation e leʻi faʻamoemoeina.Laulau Faʻaopoopo 1) 37, 38, 39. O le mea e mataʻina ai, ua uma ona faʻafefeteina le NT i totonu ole 10 minute i le maualuga ole ≥ 300 mg / mL (Fig 1c).Fa'ata'ita'iga fa'aliliuga vial fa'atasi ai ma fa'atonuga eseese o le NT na fa'aalia ai i> 50 mg/mL le vaifofo NT fa'atosina vave atu nai lo His-NT2RepCT i le fa'atatauga tutusa (w/v, Ata 1c).
Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o faufale spidrin 'ese'ese na su'esu'eina i lenei galuega.b Taimi gel i le 37 °C mo polotini spidroin recombinant eseese (300 mg/mL) fa'amaonia e ala i le fesuia'iina o le vial.CT gel vave e aunoa ma le incubation (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm fua).c Taimi Gel o le His-NT2RepCT ma le NT i faʻamatalaga faʻapipiʻi porotini i le 37°C.d Ata o Ana-NT2RepCT ma NT hydrogels o loʻo iai le apogaleveleve ma le mataitusi "NT" o loʻo lolomi i lalo, faʻasologa (e lua 200 mg/mL, fua fua 5 mm).
Hydrogels e faia i polotini spidroin recombinant eseese e iai sina lanu eseese, ma o le mata'ituina o mata e iloa ai le eseese o tikeri o le manino (Ata 1b).NT gels e matua manino lelei ae o isi gels e faʻafefe.O lana-NT2RepCT ma le NT gels na lafoina i totonu o faʻagogo paʻu e mafai ona aveese mai le limu e le atoatoa (Fig. 1d).
Ina ia su'esu'e pe fa'agata fa'alava fa'alenatura fa'alavalava silika gel i lalo o tulaga ua maua nei e mafua ai le fa'agataina o polotini spidroin recombinant, sa aoina mai fa'alavalava mai le gland ampulla tele o le apogaleveleve alalaupapa Suetena (Larinioides sclopetarius).Coatings na teuina i le 20 mM Tris-HCl buffer i le 50 mg / mL (faʻavae i luga o le fuaina o le mamafa mamago), ae leai se faʻafefe na matauina i le 21 aso faʻamaʻi i le 37 ° C (Faʻaopoopoga Ata 2a).
Ina ia faʻatatauina nei gels, e mafai ona faʻaogaina fua faʻasolosolo e suʻesuʻe ai le faʻagasologa o le gelation ma fuafua ai mea faʻainisinia atoa.Aemaise lava, o le mataituina o le teuina o modulus (elasticity) i le maualuga o le vevela e mafai ona maua ai faʻamatalaga i luga o le vevela gelling faʻapea foʻi ma mea viscoelastic o le ufiufi.Faʻataʻitaʻiga o le maualuga o le vevela (faʻaaogaina le 1 ° C / min i le 25-45 ° C, faʻavae i luga o suʻesuʻega talu ai e faʻaaoga ai fofo silika masani) 40,41 na faʻaalia ai o le teuina o moduli o Ana-NT2RepCT ma NT fofo faʻateleina i le faateleina o le vevela.na fa'ateleina (Ata 2 ma Fa'aopoopo Ata 3).O le mea moni, o le NT module na amata faʻatupulaia i le maualalo o le vevela pe a faʻatusatusa i le His-NT2RepCT, e ogatasi ma le vave o le gel taimi na matauina pe a faʻapipiʻi saʻo le NT ma Lana-NT2RepCT i le 37 ° C (Ata 1).Ina ua maeʻa le pa'ū mulimuli ane o le vevela, e leʻi toe foʻi le faʻaogaina o le teuina i tau maualalo ma tumau pea i luga aʻe o le gau (silasila i le Ata Faʻaopoopo 3), e faʻaalia ai le faʻafefeteina e le mafai ona toe faʻaleleia.I le maeʻa ai o le gelation, o le faʻamaʻi faʻasolosolo mulimuli na amata mai i le 15 i le 330 kPa mo His-NT2RepCT hydrogels i le faʻatonuga o le 100-500 mg / mL, ma le faʻauʻu mulimuli mo le NT hydrogels (100-500 mg / mL) mai le 2 i le 1400. kPa (Fig., 2 ma faʻamaumauga faʻauma atoatoa) vaʻai Faʻaopoopo Ata 3).
a Suiga i le vevela a'o fuaina o le His-NT2RepCT (300 mg/mL) ma le b NT (300 mg/mL) fa'atasi ma le lulu.O aū o loʻo faʻaalia ai le maualuga o le vevela, ma o le paolo mama o faʻamaumauga faʻapipiʻi faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai le suʻega i lalo ifo o tau mo le meafaigaluega nai lo le faʻamaonia e le gaosiga, o le mafuaʻaga lea o le faʻateleina o le pisa.c Fa'ai'uga fa'aputuga o lona-NT2RepCT ma le NT pe a uma le maualuga o le vevela (100, 300, ma le 500 mg/mL).O faitauga uma o module e ave ile taimi ole 0.1Hz.
I le avea ai o se auala talafeagai mo le suʻesuʻeina o suiga faʻatatau e fesoʻotaʻi ma gelation, matou te faʻamauina FTIR spectra o His-NT2RepCT ma NT i luma ma pe a maeʻa gelation i le 37 ° C (Ata 3a, b).E pei ona faʻamoemoeina, o le spectra o Ana-NT2RepCT ma NT fofo e fetaui ma polotini o loʻo faʻaalia ai le α-helix / random coil fausaga lona lua, faʻatasi ai ma se faʻaupu faʻaupu i le 1645 cm-1.Mo hydrogels uma e lua, o le gelation na mafua ai le faʻavaeina o lima e lua i le ogatotonu I fusi e tusa ma le 1617 cm-1 ma le 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), e faʻaalia ai le faʻavaeina o fausaga β-sheet antiparallel.O nei suiga e mafai fo'i ona va'aia manino i le fa'asologa lona lua e maua mai ai ma le eseesega o le gelation spectra (Fa'aopoopo Ata 4b).O fusi e lua o le NT β-layer na sili atu ona faʻaalia nai lo le His-NT2RepCT, e faʻaalia ai o le aofaʻi o mea o loʻo i totonu o fusi β-layer i le NT hydrogel na maualuga atu nai lo le NT2RepCT hydrogel.
se FTIR absorption spectra o His-NT2RepCT ma b NT (uma 500 mg/mL) a'o le'i (fofo) ma ina ua uma le (gel) incubation i le 37°C.c ata TEM o 50 mg/ml NT2RepCT gels ma le NT ua toe fa'asaoina.Fua fua 200 nm.u Fibre diameters o His-NT2RepCT ma NT hydrogels.n = 100 fuaina fibrils, p <0.0001.O fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'aalia ai le va'aiga masani.O le ogatotonu o fa'amau sese o le uiga.O se su'ega-t e le'i fa'aluaina (lua si'usi'u) na fa'aaogaina mo su'esu'ega fa'afuainumera.f ThT fluorescence o polotini spidroin recombinant eseese (100 mg/mL) i le 37 °C e aunoa ma le luluina.g NT (100 mg/mL) fa'ata'ita'iga tui mai le 100 mg/mL NT gel fa'atasi ma fatu 0%, 5%, 10%, ma le 20%.
O suʻesuʻega o le gel e faʻaaoga ai le microscopy electron transmission (TEM) na faʻaalia ai o le hydrogel e aofia ai fibrils pei o le amyloid (Fig. 3c, 3d).O fibrils na faia e le NT na faʻalauteleina (5-12 nm le lautele) ma le le faʻatupuina, aʻo His-NT2RepCT fibrils e pupuu le umi ma sili atu le lautele o le lautele (7-16 nm) (Fig. 3e).O nei taunuʻuga na mafai ai ona matou mulimulitaʻia le kinetics o fibrosis e faʻaaoga ai le thioflavin T (ThT) suʻega.Mo polotini spidroin recombinant uma, ua faateleina le faailo fluorescent pe a faʻataʻitaʻiina faʻataʻitaʻiga i le 37 °C (Fig. 3f, Faʻaopoopo Fig. 5a).E ogatasi ma lenei suʻesuʻega, suʻesuʻega microscopic o le NT ma le His-NT2RepCT i lalo o le gelling tulaga na faʻaalia ai se faʻaopoopoga tutusa i le ThT fluorescence e aunoa ma se faʻaputuga faʻapitonuʻu o ThT-positive aggregates (Faaopoopo Ata 5b, c).O le faʻavaeina o fibrils ThT-positive e leʻi faʻatasi ma le faʻateleina o le NT ma le His-NTCT turbidity (Faʻaopoopo Fig. 5d), o lona uiga e mafai ona fausia se fesoʻotaʻiga o fibrils i le gel e aunoa ma le faʻafefeina o le manino o gel.O le totoina o fatu e ala i le faʻaopoopoina o ni nai fibrils na muaʻi faia e mafai ona faʻavavevaveina le faʻatupuina o fibril o nisi amyloids42,43,44 ae faʻaopoopo le 5%, 10% poʻo le 20% (w / w) NT i se vaifofo o NT hydrocoagulants.aafiaga o le fatu (Ata 3g).Masalo e mafua ona o le mea moni o fibrils i le hydrogel e faʻamautu ma e le mafai ona faʻaaogaina e fai ma fatu.
O amioga fa'afuase'i a polotini spidroin toe tu'ufa'atasia i le maualuga o le vevela na fa'aosofia atili ai su'esu'ega fa'akomepiuta faaniukilia maneta (NMR) e iloa ai suiga fa'atusa e feso'ota'i ma le fa'avaeina o gel.NMR spectra o Ana-NT2RepCT fofo faʻamaumau i le taimi i le 37 ° C na faʻaalia ai o loʻo gaugau pea le CT, ae o faʻailoga NT ma 2Rep ua mou atu (Fig. 4a), faʻapea o le NT ma le 2Rep o loʻo faʻatonuina le faʻavaeina o His- NT2RepCT hydrogel.O le faailo o le CT na faʻaititia foʻi i le 20% o lona malosi muamua, faʻapea o le CT e tele lava ina faʻamautu ma faʻapipiʻiina i totonu o le fausaga o le hydrogel.Mo se vaega laʻititi o le CT, lea e pei o le telefoni feaveaʻi e pei o le faʻataʻitaʻiga muamua ma faʻapea ona matauina e le fofo NMR, o le spectra e leai ni faailoilo mo le 10 muamua faʻatulagaina toega, atonu ona o le faigata ona faʻaogaina o le vaega faʻapipiʻi o Lana-NT2Rep.O le NMR spectra o le -state of hydrogels -NT2RepCT na faʻaalia ai le tele o le i ai o α-helices ma β-layers ma, i se tulaga maualalo, o le faʻaogaina o le coil faʻafuaseʻi (Fig. 4b).Ole su'esu'ega ole su'esu'ega ole methionine o lo'o iai ile NT na fa'aalia ai ua liua lenei vaega ile fausaga β-pepa.O le va'aiga fa'alagolago i le taimi o le NT i le fofo na fa'aalia ai le fa'aitiitia o le fa'aitiitiga o le fa'ailo (Fig. 4c), ma le NMR o le NT hydrogels na fa'aalia ai o le tele o toega NT na liua i fausaga β-pepa (Fig. 4d).O le fa'atulagaina o le 2Rep e le'i mafai ona fa'avasega fa'atasi ona o lona fa'atupu fa'atasi.Ae ui i lea, o le tulaga mausali NMR spectra o le NTCT ma His-NT2RepCT hydrogels e foliga tutusa lava (Fig. 4b; Faʻaopoopo Fig. 6b), faʻapea mai o le 2Rep e itiiti sona sao i le vaega faʻavae o le His-NT2RepCT hydrogel.Mo CT hydrogels, α-helices, β-pepa, ma faʻasologa faʻasolosolo lua fausaga faʻasolosolo na maua (Faʻaopoopo Ata 6d).O lo'o ta'u mai ai o nisi vaega o le CT e tumau pea i le α-helices ae o isi e avea ma β-pepa.O le mea lea, o faʻaiʻuga o le NMR spectroscopy o loʻo fautua mai ai e taua le NT mo le faʻavaeina o le hydrogel ma faʻaliliuina foi i se β-sheet conformation i luga o le fusi ma le 2Rep ma le CT.E tusa ai ma lenei mea, na matou iloa talu ai nei o le amyloid spatial zippers e foliga mai o loʻo i ai i totonu o helices uma e lima o le NT domain, ma o le Waltz algorithm na valoia se vaega amyloidogenic i le helix 1 (Fig. 4e).
2D spectra o le 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT fofo a'o le'i (lanu moana) ma le 19 itula ina ua uma ona fa'atupu (mumu) ile 37°C.O tumutumu o le koluse ta'ito'atasi i le fusi mūmū ma le F24, G136, polyA i le fusi lanumoana o lo'o fa'ailoaina i mataitusi tasi fa'ailoga amino acid ma numera o totoe.O faʻamaufaʻailoga o loʻo faʻaalia ai le faʻalagolago i le malosi o le faailo i le taimi mo toega filifilia mai le NT, 2Rep, ma le CT domains.b Fa'aola alaleo (RFDR) alaleo o Ana-NT2RepCT hydrogels.O faʻasalalauga o toega Cα / Cβ na matauina i le RFDR spectra na fuafuaina e ala i le faʻatusatusaina ma faʻataʻitaʻiga peptide vailaʻau suiga ma tau e maua mai statistics82,83 ma o latou fausaga lona lua.SSB – taamilo i autafa.i Alaleo e tasi-dimensional o le 15N-HSQC 10 mg/mL NT fofo i le taimi o le incubation i le 37 °C mo le 36 itula.O lo'o fa'aalia e le fa'aulufale le malosi o le volumetric ma le taimi.d tulaga mautu RFDR spectrum o NT hydrogels.O fesoʻotaʻiga o toega Cα / Cβ ma o latou fausaga lona lua o loʻo matauina i le RFDR spectra o loʻo faʻaalia.e Fa'avae i luga o le fa'amatalaga fa'anatura NT45.79 fibrillation propensity mai le Zipper database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Ole malosi ole Rosetta ole fa'amalama fa'amalama ole uila ole hexapeptide o lo'o fa'aalia ile kcal/mol.O pa mumu e faʻaalia ai hexapeptides e maualuga le fibrosis propensity (Rosetta malosi i lalo -23 kcal / mol; lalo ifo o le laina togitogi).Fa'amau lanu meamata e fa'ailoa mai ai ni vaega o lo'o iai le malosi o Rosetta i luga a'e o le faitoto'a ma o lea e fa'aitiitia ai le fa'atupuina o sipa fa'amau.O fasi vaega o lo'o i ai le proline na le aofia ai mai le su'esu'ega (e aunoa ma ni koluma).O sikuea o loʻo faʻaalia ai vaega o le amyloidosis na valoia e le Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).O le fa'asologa o toega amino acid o le NT o lo'o i le pito i luga, ma o ituaiga o toega o lo'o maua i le fausaga lona lua o le β (fa'atulagaina e le NMR spectroscopy solid-state) o lo'o fa'aalia i le mumu.O tulaga o le lima NT α-helices ua faʻatulagaina o le (H1-H5)28.
I le pH <6.5, e fa'aitiitia le HT, e tete'e i le vevela po'o le urea-fa'aoso denaturation18.Ina ia faʻamalamalamaina pe faʻafefea ona aʻafia le faʻaogaina o le NT dimerization ma le mautu, fofo o loʻo i ai le 100 mg / ml NT na faʻatonutonuina i le pH 8, 7, ma le 6 e faʻaaoga ai le suʻega faʻaliliuina o fagu.O faʻataʻitaʻiga NT na faʻapipiʻiina i le pH 8 ma le 7 gelled i le maeʻa ai o le 30 min i le 37 ° C, ae o le pH 8 gel na tumau pea le manino, ae o le pH 7 gel na faʻaalia ai se paʻu vaaia (Fig. 5a).I se faʻatusatusaga, o se vaifofo o loʻo i ai le HT ile pH 6 e leʻi fausia ai se gel, ma e mafai ona iloa se paʻu tele pe a uma le 20 min i le 37 ° C.O lo'o ta'u mai ai e fa'apea o dimers i latou lava ma/po'o lo latou mautu maualuga pe a fa'atusatusa i monomers e puipuia ai le fa'a'ele'ele.O le faʻavaeina o se paʻu mo le NT i le pH 7 ma le 6 e leʻi faʻamoemoeina, talu ai ua lipotia mai o le NT e solu i le 200 mg / ml27, faigofie ona toe faʻafoʻi pe a maeʻa le vevela, ma tumau ai foi se α-helix i tau maualalo o le. pH 18. O se faʻamatalaga faʻapitoa mo nei eseesega e faapea o faʻataʻitaʻiga na lipotia muamua na faia i le vevela o le potu poʻo lalo ifo, poʻo i le maualalo o le protein concentrations16,18,19.
NT vial inversion test (100 mg/mL) i le pH 8, 7, 6 ma le 154 mM NaCl (pH 8) pe a uma ona fa'a'ofu i le 37°C.b NT CD spectra fa'atasi ma e leai se 154 mM NaF ma le 154 mM NaCl.Molar ellipticity i le 222 nm ua liua i se vaega o gauga masani.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C ma le 60 °C), NTA72R (37 °C), ma Lana-NT-L6 (37 °C ma 60 °C).d CD spectra o NT mutants NT*, NTA72R, ma Lana-NT-L6.Molar ellipticity i le 222 nm ua liua i se vaega o gauga masani.u Su'ega fa'aliliuina o le NTFlSp, NTMiSp ma le fa'aititia o le NTMiSp (100 mg/mL).Fua pa 5 mm.f CD spectra o NT, NTFlSp, NTMiSp ma faʻaititia NTMiSp.Molar ellipticity i le 222 nm ua liua i se vaega o gauga masani.Fa'aaliga atoa NT ile 25 °C ma le 95 °C o lo'o fa'aalia i le Fa'atusa Fa'aopoopo 8.
O le fa'aogaina o le masima fa'aletino e fuafua ai feso'ota'iga electrostatic i le va o NT subunits ma le dimerization o le NT fa'aliliu i lalo pH18.Na matou iloa o le i ai o le 154 mM NaCl ma le NaF na matua taofia ai le gelation, i le faasologa (Fig. 5a, b; Faʻaopoopo Fig. 2b) ma o nei masima na faʻateleina ai le mautu o le NT monomers (Fig. 5b, Faʻaopoopo Fig. 8) .O loʻo fautua mai ai foʻi o le faʻaleleia atili o le mautu, nai lo le dimerization, e taofia ai le faʻavaeina o gel.
Ina ia toe suʻesuʻe atili le matafaioi o le faʻavasegaina o porotini ma le mautu i le gelation, matou te faʻaogaina le lua mutants, NT * ma le NTA72R, lea e tumau pea le monomeric i le pH28.30 maualalo.O le NT* o se mutant toe fa'aluaina le totogi lea e fa'amafola ai le fa'asoasoaina o le tau o le dipolar o le monomer, lea e taofia ai le dimerization ma fa'ateleina ai le mautu o le monomer.O le NTA72R o se dipole ua molia, ae o le Arg-substituted Ala o loʻo i le tuaoi dimer, o lea e faʻalavelave ai suiga i fesoʻotaʻiga laiti e manaʻomia mo le dimerization.I luga o le incubation i le 37 ° C, NT * e leʻi fausia se hydrogel, aʻo NTA72R na fausia se gel opaque mo 15 min (Fig 5c).Talu ai e le mafai e le NT * ma le NTA72R ona faʻaitiitia ae eseese i le mautu o le monomer (Fig. 5d), o nei faʻaiʻuga e faʻaalia malosi ai o le maualuga o le thermodynamic e taofia ai le NT mai le gelling.E lagolagoina foi lenei mea i le mea moni o le HT * e faia se gel pe a le mautu i le maualuga o le vevela (pe a uma le 8 min i le 60 ° C; Ata 5c).Na fa'aalia muamua o le maualuga o mea o lo'o i totonu o le methionine i totonu o le NT e fa'amaluluina ai lona gaugau fa'anatura ma e ono Met to Leu suitulaga (ua ta'ua i'inei o His-NT-L6) fa'amautu malosi le NT46 monomer.Faʻavae i luga o le manatu e manaʻomia le fetuunaiga o le fausaga mo le faʻavaeina o le gel NT, na matou iloa ai o le His-NT-L6 stable mutant e leʻi gel i le 37 ° C (Ata 5c, d).Ae ui i lea, na faia foi e le His-NT-L6 se gel i luga o le incubation i le 60 ° C mo le 60 min (Fig 5c).
O le malosi o le NT e liua i β-sheet structures ma fai hydrogels e foliga mai e faʻaoga i nisi ae le o vaega NT uma o le spidroin.NTs mai ituaiga siliki eseese ma ituaiga apogaleveleve, Trichonephila clavipes (NTFlSp), na fausia ni gels e ui lava i lo latou maualalo maualalo o le methionine ma le maualuga o le mafanafana (Fig. 5e, f ma le Laulau Faaopoopo 2).I le faʻatusatusaga, NT mai le spidroin protein ampullar laʻititi mai Araneus ventricosus (NTMiSp) faʻatasi ai ma le maualalo o le vevela ma le maualuga o le methionine e leʻi fausia ai ni hydrogels (Laulau Faʻaopoopo 2 ma le Ata 5e, f).O le mea mulimuli e mafai ona fesoʻotaʻi ma le i ai o soʻotaga disulfide intramolecular29,47.Faʻatasi, ina ua faʻaitiitia le faʻamauina o le disulfide o le NTMiSp, na fausia ai se hydrogel pe a uma ona faʻafefe i le 37 ° C mo le 10 min (Fig. 5e).I le faaiuga, e tatau ona maitauina o le fetuunaiga o le faʻatulagaina o se mea taua, ae le naʻo le pau lea, faʻataʻitaʻiga mo le faʻavaeina o se gel mai le NT.O le isi itu e ono talafeagai o le faʻaalia lea o le amyloid fibrils, ma le suʻesuʻeina ma le sipa faʻamaumauga ma le Waltz algorithm na faʻaalia ai se faʻamaopoopoina i le va o le mafai ona fai gels ma le i ai o vaega amyloidogenic, faʻapea foʻi ma le lautele o itulagi na valoia. e fai ai sipa steric.Sa i ai se fa'amaopoopo (Laulau Fa'aopoopo 2 ma le Ata Fa'aopoopo 9).
O le malosi o le NT e fai ai fibrils ma fai ai gels i lalo o tulaga lelei na ta'ita'ia ai i matou e fa'apea o fusuaga o le NT ma isi vaega o porotini e mafai lava ona fausia ai ni gels ma galuega atoatoa a pa'aga fusi.Ina ia faʻataʻitaʻiina lenei mea, matou faʻafeiloaʻi le polotini lanumeamata lanumeamata (GFP) ma le purine nucleoside phosphorylase (PNP) i le C-terminus o le NT, i le faasologa.O polotini fusuaga na maua mai na faʻaalia i le E. coli ma le maualuga maualuga o fua faʻaiʻuga (150 mg / L ma le 256 mg / L faʻamaʻi faʻamaʻi fuʻa mo His-NT-GFP ma His-NT-PNP, i le faasologa), e ogatasi ma mea ua faʻaalia. mo Isi polotini ua fusia i le NT Ref.30. O lana-NT-GFP (300mg/mL) ma Ana-NT-PNP (100mg/mL) fusion proteins na fausia ai gels pe a uma le 2 itula ma le 6.5 itula i le 37 ° C ma, o le mea taua, o le vaega GFP na tumau pea e le suia.matauina pe a maeʻa le faʻafefeteina, faʻatasi ai ma le> 70% o le malosi muamua o le fluorescence o loʻo totoe pe a maeʻa le faʻafefe (Fig. 6a).Ina ia fua le gaioiga PNP i ana-NT-PNP fofo ma gels, e tatau ona matou faʻafefeteina le fusi faʻatasi ma le NT ona o le gaioiga enzymatic o le sauniuniga mama sa i fafo atu o le vaʻaiga o suʻesuʻega i le faʻaogaina o gelling.O le gel na faia i se faʻafefiloi o loʻo i ai le 0.01 mg / mL His-NT-PNP ma le 100 mg / mL NT na taofia le 65% o le gaioiga muamua o le enzymatic o faʻataʻitaʻiga muamua (Fig. 6b).Na tumau pea le gel i le taimi o le fua (Faʻaopoopo Ata 10).
O le malosi ole felafolafoa'i fa'atusatusa a'o le'i mae'a ma le fa'a'ele'ele o le His-NT-GFP (300 mg/mL) ma le fagu fa'aliliuina o lo'o i ai Lona-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) i lalo ole malamalama va'aia ma le UV.O fa'ailoga e fa'aalia ai fua ta'ito'atasi (n = 3), fa'ailoga fa'aletonu o lo'o fa'aalia ai le va'aiga masani.O le tau averesi o loʻo faʻaalia i le ogatotonu o faʻamau sese.b PNP gaoioiga na maua e fluorometric suʻesuʻega e faʻaaoga ai fofo ma gels e aofia ai le NT (100 mg / ml) ma se paluga o loʻo i ai le 0.01 mg / ml lana-NT-PNP ma le 100 mg / ml New Taiwan dollars.O lo'o fa'aalia i totonu o le fa'ailoga se fagu fa'aliliu'ese o lo'o iai se hydrogel o lo'o iai le His-NT-PNP (5 mm scale bar).
O iinei, matou te lipotia ai le faʻavaeina o hydrogels mai le NT ma isi polotini spidroin recombinant e ala i le incubating o se vaifofo porotini i le 37 ° C (Ata 1).Matou te faʻaalia o le gelation e fesoʻotaʻi ma le suiga o le α-helices i β-layers ma le faʻavaeina o fibrils pei o le amyloid (Fig. 3 ma le 4).O lenei sailiga e ofo ai ona o NTs o loʻo faʻapipiʻiina fusi lima-helix globular ua iloa ona o lo latou maualuga maualuga o le solubility ma le mautu maualuga i faʻatonuga> 200 mg / mL i le 4°C mo ni nai aso27.E le gata i lea, o NT e faigofie ona toe fa'afo'i pe a mae'a le vevela i le maualalo o le polotini i le µM.E tusa ai ma a matou faʻaiʻuga, o le faʻapipiʻiina o fibril e manaʻomia ai se tuʻufaʻatasiga o le> 10 mg / mL faʻasologa o porotini ma sina maualuga maualuga o le vevela (Fig. 1).E o gatasi lea ma le manatu e mafai ona maua mai le amyloid fibrils mai polotini gaugau i le globularly o lo'o i totonu o se vaega o lo'o matala ona o fesuiaiga o le vevela i lalo o tulaga o le tino 48 .O faʻataʻitaʻiga o polotini e maua i lenei suiga e aofia ai insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin ma lysozyme51,52,53.E ui lava o le NT o se α-helix i lona tulaga moni, e tusa ma le 65% ​​o le filifili polypeptide e fetaui ma le faʻaogaina o le sipa (Fig. 4e) 45.Talu ai o le monomer e malosi tele46, e mafai ona faʻaalia ai nei vaega amyloidogenic ono mafai i le maualuga o le vevela ma i le maualuga o le maualuga o le porotini atoa e mafai ona oʻo atu i se faʻalavelave taua mo le amyloid fibril formation54.I le mulimuli ai i lenei manatu, na matou maua ai se faʻamaopoopo le lelei i le va o le spidroin concentration ma le gelation time (Fig. 1c), ma afai o le monomeric NT conformation e faʻamautuina e ala i suiga (NT *, His-NT-L6) poʻo le faʻaopoopoga masima, e mafai ona puipuia le fausia hydrogels (Ata. 5).
I le tele o tulaga, o le amyloid fibrils e mou atu mai le vaifofo e pei o se faʻafefe, ae i lalo o nisi tulaga e mafai ona latou fausia hydrogels55,56,57.Hydrogel-forming fibrils e masani lava ona i ai se fua fa'atatau maualuga ma fa'amautu feso'ota'iga tolu-dimensional e ala i le mole mole entanglement,55,58 o gatasi ma a tatou taunu'uga.Mo le faʻavaeina o le hydrogel in vitro, o polotini e masani ona faʻaalia atoa poʻo se vaega, mo se faʻataʻitaʻiga, e ala i le faʻaalia i soʻo faʻalagona, maualuga maualuga (70-90 ° C) ma / poʻo le maualalo o le pH (1.5-3.0) 59,60,61,62.O le spidroin hydrogels o loʻo faʻamatalaina iinei e le manaʻomia ai se faiga faʻamalosi, e le manaʻomia foʻi ni soʻo fesoʻotaʻiga e faʻamautu ai hydrogels.
Na lipotia muamua o le spidroin toe fai ma QDs, lea e foliga mai o loʻo i ai le suiga o le β-pepa i le taimi o le vili siliki, e fausia ai hydrogels.Pe a faʻatusatusa i a matou suʻesuʻega, o taimi faʻafefe ma / poʻo le vevela o le vevela na sili atu le umi pe sili atu, i le faasologa, ma o le mea e maua mai ai hydrogels e masani ona faʻafefe (Ata 7 ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. I le faaopoopo atu i taimi vave gel, NT hydrogels> 300 mg / mL (30%) na sili atu i isi faʻataʻitaʻiga faʻamatalaina recombinant silk protein hydrogels, faʻapea foʻi ma hydrogels masani e pei o gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) ma collagen.(0.6%) (Ata 7 ma Laulau Faaopoopo 1 ma le 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
O le taimi o gel ma le faʻaogaina o le hydrogels i lenei suʻesuʻega na faʻatusatusa i isi hydrogels faʻavae spidroin ma vai faʻalenatura filifilia.O faʻamatalaga o loʻo tuʻuina atu faʻatasi ma se faʻamatalaga o tulaga gelation.APS Ammonium persulfate, vevela potu.Fa'amaumauga 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
O apogaleveleve e foliga mai na faia ni auala e puipuia ai le spidroin mai gelling i le taimi e teu ai.E ui lava i le maualuga maualuga o le polotini i le silk gland, o le tele o le toe faia o le itulagi e fesoʻotaʻi ma le pito i tua o lona uiga o le faʻaaliga manino o le NT ma le CT i le gland e fetaui ma le 10-20 mg / ml, i le tuaoi o lenei suʻesuʻega.e manaʻomia mo le faʻavaeina o le hydrogel i vitro.E le gata i lea, o fa'aputuga tutusa o masima 16 fa'amautu le NT, e pei o le silika (Ata 5b).O le NT conformation na suʻesuʻeina i le E. coli cytosol ma maua ai e sili atu ona gaugau nai lo le suʻesuʻeina in vitro, ma faʻaalia atili ai o le masima poʻo isi mea e taofia ai lona faʻapipiʻiina i vivo.Ae ui i lea, o le gafatia o NTs e liua i β-pepa fibrils atonu e taua mo le fausiaina o filament ma e tatau ona suʻesuʻeina i suʻesuʻega i le lumanaʻi.
I le faaopoopo atu i le tala fou o le NT-amyloid-pei o le fibril ma le hydrogel formation o loʻo matauina i lenei suʻesuʻega, matou te faʻaalia foi o lenei mea faʻapitoa e mafai ona i ai ni faʻaoga faʻapitoa ma biomedical (Fig. 8).I le avea ai o se faʻamaoniga o manatu, matou tuʻufaʻatasia le NT ma le GFP poʻo le PNP ma faʻaalia ai o le fusion protein e fausia ai foʻi hydrogels pe a faʻapipiʻiina i le 37 ° C ma o le vaega o le GFP ma le PNP e tele lava ina taofi a latou gaioiga pe a maeʻa faʻafefe (Ata 6).Nucleoside phosphorylases o mea taua e faʻapipiʻi faʻasologa o nucleoside analogues75, lea e faʻatatau ai la matou sailiga mo le pisinisi biopharmaceutical.O le manatu o le faʻaalia o polotini fusuaga e fausia ai hydrogels manino i lalo o tulaga lelei e mafai ai ona fausia ni hydrogels faʻaogaina ma mea lelei mo le tele o faʻaoga e pei o le enzyme immobilization, faʻatonutonuina o vailaʻau faʻamalolo ma masini faʻainisinia.E le gata i lea, o le NT ma le NT* o ni faailoga faʻaalia lelei30, o lona uiga o le NT ma ona suiga e mafai ona faʻaaogaina mo le gaosiga maualuga o palatini soluble fusifusia ma mulimuli ane faia o polotini taulaʻi immobilized i 3D hydrogels.
O le NT e solu, α-helical ma mautu i le maualalo o fa'atonuga (µM) ma le 37°C.I le vevela lava e tasi, ae i le faʻateleina o faʻasalalauga (> 10 mg / ml), o le NT e fai ai gels e aofia ai fibrils pei o le amyloid.O polotini fusuaga NT e fausia ai fo'i gels fibrillar fa'atasi ai ma vaega fusuaga atoatoa, e fa'atagaina ai polotini 'ese'ese e fa'asa'o ile 3D hydrogels e fa'aaoga ai le NT.Lalo: NT (PDB: 4FBS) ma faʻataʻitaʻiga o fesoʻotaʻiga fiber ma faʻapipiʻi porotini e fesoʻotaʻi (faʻapea ae le faʻatusaina i le fua, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
O faufale (silasila i le Laulau Faaopoopo 4 mo se lisi atoa e aofia ai faʻasologa o le amino acid) na faʻapipiʻiina i le plasmid pT7 ma suia i le E. coli BL21 (DE3).E. coli o loʻo i ai plasmids faʻainisinia na tui i totonu o le Luria broth faaopoopo i le kanamycin (70 mg / l) ma ola i le po i le 30 ° C ma le 250 rpm.O le aganuʻu na faʻapipiʻiina le 1/100 i totonu o le LB medium o loʻo iai kanamycin ma faʻatupuina i le 30 ° C ma le 110 rpm seia oʻo i le OD600 i le 0.8.Mo suʻesuʻega a le NMR, na tupu aʻe siama i le M9 laʻititi laʻititi o loʻo i ai le 2 g o le D-glucose 13C (Aldrich) ma le 1 g o le ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) mo le faʻailogaina o porotini ma isotopes.Fa'aititia le vevela ile 20 tikeri Celsius ma fa'aoso le fa'aaliga o porotini ile 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (fa'ai'uga fa'ai'uga).A maeʻa le faʻaaliga o le protein i le po, na seleseleina sela i le 7278 × g, 4 ° C mo le 20 min.O pellets sela na toe fa'amalo i le 20 mM Tris-HCl, pH 8, ma fa'aaisa se'ia toe fa'aoga.Na fa'amama sela fa'afefeteina e fa'aaoga ai se fa'alavelave fa'alavelave (masini fa'asologa TS, Constant Systems Limited, Egelani) i le 30 kPa.Ona fa'auluina lea o lysates i le 25,000 g mo le 30 minute i le 4 ° C.Mo NTMiSp, o le pellet na toe faʻafouina i le 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ma sonicated mo le 2 min (2 s on / off, 65%), ona toe faʻaogaina lea i le 25,000 xg, 4 ° C. i totonu. 30 min.O le supernatant sa utaina i luga o se koluma Ni-NTA, fufuluina i le 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ma mulimuli ane faʻafefeteina le polotini i le 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. E gaosia ai le NT2RepCT ma NTCT, thrombin digestion e fa'ailoa ai le saite (ThrCleav) i le va o Lana ma NT.Thrombin cleavage sites o loʻo iai foʻi i Lana-NT-ThrCleav-2Rep (e maua ai le 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (tuuina NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (gaga CT), Lana-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (tupu NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (gaua le NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (gauina NTF1Sp), ma His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (gaua NTMiSp).O mea faufale na faʻafefeteina i le thrombin (1: 1000) ma faʻapipiʻiina i le po i le 4 ° C. ma le 20 mM Tris-HCl, pH 8, faʻaaogaina le Spectra / Por dialysis membrane faʻatasi ai ma le mamafa o le mole mole 6-8 kDa.A mae'a le fa'amama toto, ona uta lea o le vaifofo i luga o se koluma Ni-NTA ma fa'aputuina le otaota o lo'o iai le polotini o tului.O fa'aputuga o polotini na fa'amauina e ala i le fuaina o le su'esu'eina o le UV i le 280 nm e fa'aaoga ai le fa'amutaina o porotini ta'itasi, se'i vagana ai le NTF1Sp, lea na fa'aogaina ai le su'esu'ega a Bradford e tusa ai ma le fa'atonuga a le gaosiga.O le mama na fuafuaina e le SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis ma Coomassie lanu lanumoana susulu.O polotini na faʻapipiʻiina i le faʻaogaina o le centrifuge filters (VivaSpin 20, GE Healthcare) i le 4000 xg faʻatasi ai ma le 10 kDa molecular weight cutoff i 20 minute cycles.
Fa'asusu le vaifofo polotini ma paipa ma le faaeteete le 150 µl i totonu o se fagu septum manino 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Sa pupuni faagaau ma fa'amaufa'ailoga i le parafilm e taofia ai le fa'asa.O faʻataʻitaʻiga (n = 3) na faʻapipiʻiina i le 37 ° C poʻo le 60 ° C ma fesuiaʻi i lea taimi ma lea taimi e mataʻituina le gelation.O faʻataʻitaʻiga e leʻi faʻafefeteina na faʻapipiʻiina mo le itiiti ifo ma le tasi le vaiaso.Fa'aiti'itia fa'amauga disulfide NTMiSp fa'atasi ma le 10 mM DTT ile 10 µM porotini.Ina ia faʻavasega le gelation o paʻu siliki apogaleveleve natura, na tipiina le apogaleveleve alalaupapa Suetena, o le lua ampullated glands autu na tuʻuina i le 200 μl o le 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ma tipi e faʻatagaina le ufiufi e vavae ese mai le glands..O mea o loʻo i totonu o le gland e faʻamavaeina i totonu o le paʻu, 50 μl mo le fuafuaina o le mamafa mamago (e ala i le faʻapipiʻiina o fagu tatala i le 60 °C i le mamafa tumau) ma le 150 μl mo gelation i le 37 °C.
Ole fua ole geometry/meafaigaluega e faia ile u'amea u'amea e fa'aaoga ai se ipu tutusa ma le maualuga pito i luga ole 20 mm ma le va ole 0.5 mm.Fa'avevela le fa'ata'ita'iga mai le 25 °C i le 45 °C ma toe fo'i i le 25 °C ile fua ole 1°C ile minute e fa'aaoga ai le peltier plate pito i lalo.O fua o le vibrational na faia i se taimi ole 0.1 Hz ma i le laina viscoelastic itulagi o mea i se faʻalavelave o le 5% ma le 0.5% mo faʻataʻitaʻiga o le 100 mg / mL ma le 300-500 mg / mL, faasologa.Fa'aaogā se potu susū masani e puipuia ai le fa'asa.Sa suʻesuʻeina faʻamatalaga e faʻaaoga ai le Prism 9.
Mo le aoina o alaleo infrared (IR) ile vevela potu mai le 800 i le 3900 cm–1.O le masini ATR, faʻapea foʻi ma le auala malamalama e ala i le spectrometer, e faʻamamāina i le ea mamago mama aʻo leʻi faia ma aʻo faia le suʻega.O fofo (500 mg / mL e faʻaitiitia ai le faʻafefe o le vai i le spectra) sa paipa i luga o tioata, ma gels (500 mg / mL) na faia aʻo leʻi fuaina ona tuʻuina atu lea i tioata (n = 3).1000 faʻataʻitaʻiga na faʻamauina ma se iugafono o le 2 cm-1 ma le zero duty cycle o le 2. O le faʻasologa lona lua na faʻatatauina e faʻaaoga ai le OPUS (Bruker) e faʻaaoga ai le faʻalelei o le iva togi.O le alaleo na fa'avasegaina i le tu'ufa'atasiga tutusa i le va o le 1720 ma le 1580 cm-1 fa'aaoga F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".I le ATR-IR spectroscopy, o le loloto o le ulu o se ave infrared i totonu o se faʻataʻitaʻiga e faʻalagolago i le numera o le galu, e mafua ai le malosi o le faʻaogaina i numera o galu maualalo nai lo numera maualuga.O nei aafiaga e leʻi faʻasaʻoina mo le faʻaaliga o loʻo faʻaalia i le Ata.3 aua e laiti tele (Faaopoopo Ata 4).Fa'asa'o fa'ata'ita'iga mo lenei fa'atusa sa fa'atatau ile fa'aogaina ole polokalame Bruker OPUS.
I le mataupu faavae, e mafai ona maua se fa'atusatusaga atoatoa o fa'apolotini fa'atasi pe a mae'a fa'atuatuaina le fa'ate'aina o vaega i totonu o le amide I peak.Ae ui i lea, o nisi faʻalavelave e tulaʻi mai i le faʻatinoga.O le pisapisao i le fusi o alaleo e mafai ona aliali mai o ni tumutumu (sese) i le taimi o le deconvolution.E le gata i lea, o le pito i luga ona o le punou o le vai e fetaui lelei ma le tulaga o le amide I peak ma atonu e tutusa le maualuga mo faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le tele o vai, e pei o le gel aqueous suʻesuʻe iinei.O le mea lea, matou te leʻi taumafai e faʻaumatia atoa le amide I peak, ma o matou faʻamatalaga e tatau ona naʻo le lagolagoina o isi metotia e pei o le NMR spectroscopy.
O vaifofo o le 50 mg/ml NT ma le His-NT2RepCT sa fa'afefeteina ile po ile 37°C.O le hydrogel na faʻafefeteina i le 20 mM Tris-HCl (pH 8) i le faʻatonuga o le 12.5 mg / ml, lulu lelei ma paipa e talepe ai le gel.O le isi, o le hydrogel sa faʻafefeteina 10 taimi ma le 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl o le faʻataʻitaʻiga na faʻaaogaina i se kopa faʻapipiʻi faʻapipiʻiina i le formvar, ma o le faʻataʻitaʻiga sili atu na aveese i le pepa solo.O fa'ata'ita'iga na fufulu fa'alua i le 5 µl o le MilliQ vai ma fa'ailoga i le 1% uranyl formate mo le 5 minute.Aveese le pisia tele ile pepa fa'afefe, ona fa'agogo lea o le mata i le ea.Fa'ata'ita'iga na fa'atinoina i luga o nei fa'asologa e fa'aaoga ai le FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN o lo'o galue ile 100 kV.O ata na faamaumauina i le x 26,500 ma le x 43,000 faʻalauteleina e faʻaaoga ai le Veleta 2k × 2k CCD kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Siamani).Mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi (n = 1), 10-15 ata na faʻamauina.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) na faʻaaogaina mo le suʻesuʻeina o ata ma le fuaina o le fiber diameters (n = 100, filo eseese).O le Prism 9 sa fa'aaogaina e fa'atino ai su'ega-t e le'i fa'aluaina (lua si'usi'u).O lona uiga o Ana-NT2RepCT ma NT fibrils o 11.43 (SD 2.035) ma 7.67 (SD 1.389) nm, i le faasologa.Ole taimi fa'alagolago (95%) ole -4.246 i le -3.275.tikeri o le saolotoga = 198, p <0.0001.
80 μl o vai faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le 10 μM thioflavin T (ThT) na fuaina i faʻatolu (n = 3) i lalo o tulaga faʻapitoa e faʻaaoga ai Corning 96-well black black bottom clear bottom plates (Corning Glass 3881, USA).O eseesega o le fluorescence na faʻamauina i le faʻaaogaina o le 440 nm excitation filter ma le 480 nm emission filter (FLUOStar Galaxy mai BMG Labtech, Offenburg, Siamani).O le faailo o le ThT e leʻi tumu pe tineia, ona o faʻataʻitaʻiga ma faʻasalalauga eseese o le ThT na faia e aunoa ma le suia o le malosi o le faailo.Fa'amaumau le miti i le 360 ​​nm mo le fuaina o le pua'a.Mo suʻesuʻega fatu, 100 mg / mL gels na faia i le 37 ° C., toe faʻaleleia, ma faʻaaogaina mo le totoina i fua molar o le 5%, 10%, ma le 20%.Sa suʻesuʻeina faʻamatalaga e faʻaaoga ai le Prism 9.
Fa'asusu fa'amea ole His-NT2RepCT ma le NT >100 mg/mL ile aisa ma fa'amama ile 0.22 µm faamama.Concentrations na fuafuaina e ala i le fuaina o le absorbance i le 280 nm faʻaaoga Nanodrop.I totonu o vaieli o se ipu 96-well uliuli e le o fusifusia (Corning) ma le manino pito i lalo, faʻataʻitaʻiga na faʻafefeteina i le 20 mg / ml i le 20 mM Tris-HCl pH 8 ma faʻafefiloi ma le 5 μM ThT (faʻasalaga mulimuli), aofaʻi faʻataʻitaʻiga faʻapitoa. 50 μl voluma.O faʻataʻitaʻiga na faʻataʻitaʻiina i minute uma 10 i le 37 ° C i luga o le CellObserver (Zeiss) microscope faʻatasi ai ma le faʻaogaina o le malamalama ma le FITC faʻafiafiaga ma seti faamama faʻamalama mo ThT ata.O se tioata 20x/0.4 e fa'aoga mo ata.Zen Blue (Zeiss) ma ImageJ (https://imagej.nih.gov/) na faʻaaogaina mo le auiliiliga o ata.Na saunia foʻi gels mai NT ma His-NT2RepCT solutions i le maualuga o le 50 mg / mL o loʻo i ai le 20 mM Tris pH 8 ma le 5 µM ThT ma faʻafefe i le 37 ° C mo le 90 min.O fasi gel na faʻafeiloaʻi i se vaieli fou o loʻo i ai le 20 mM Tris, pH 8, ma le 5 μM ThT i totonu o se ipu lanu uliuli 96 manino pito i lalo.Maua le felanulanua'i lanu meamata ma ata pupula fanua ile 20x/0.4 fa'alautele.ImageJ na faʻaaogaina mo suʻesuʻega ata.
Fofo NMR spectra na maua ile 310 K ile 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer fa'apipi'iina ile QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR fa'ata'ita'iga o lo'o iai 10 mg/mL polotini tutusa ua fa'ailogaina ile 13C, 15N, fa'amavae ile 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Ole suiga ole vaila'au ole NT2RepCT ile pH 6.7 na fa'aogaina e tu'u ai le tumutumu 23 ile fusi ole 2D ole 15N-HSQC.
Fa'ailoga fa'amaneta o lo'o ta'amilomilo malosi NMR (MAS) spectra o le 13C, 15N-labeled hydrogels na fa'amauina i luga o le Bruker Avance III HD spectrometer i le 800 MHz fa'apipi'iina i le 3.2 mm 13C/15N{1H} su'esu'e e leai se eletise.Faʻataʻitaʻiga vevela na faʻatonutonuina e ala i le faʻaogaina o le vevela o le kasa i le 277 K. O le lua-dimensional dipole rotational resonance (DARR) 76 ma le leitio toe faʻafesoʻotaʻi (RFDR) 77 spectra na maua i MAS alalaupapa o 12.5 kHz ma 20 kHz, faasologa.Cross polarization (CP) mai le 1H i le 13C na faia i le faʻaogaina o le laina laina mai le 60.0 i le 48.0 kHz i le 1H, 61.3 / 71.6 kHz i le 13C (i le 12.5 / 20 kHz MAS) ma le taimi faʻafesoʻotaʻi 0.5-1 ms.Spinal6478 decoupling i le 73.5 kHz na faʻaaogaina i le taimi o le aoina o faʻamaumauga.O le taimi na maua ai e 10 milliseconds ma le fa'atuai o le taamilosaga e 2.5 sekone.O fesoʻotaʻiga Cα / Cβ faʻatasi e tasi na matauina i le RFDR spectra na tuʻuina atu e faʻavae i luga o uiga o totoe-ituaiga vailaʻau suiga ma faʻateleina fesoʻotaʻiga fesoʻotaʻiga i le DARR spectra.
O le Zipper79 database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) na faʻaaogaina e iloilo ai uiga faʻafefe ma Rosetta malosi mo NT, NTFlSp, ma NTMiSp.O le fa'amaumauga a le Zipper e fa'atatauina Rosetta Energy80, lea e tu'ufa'atasia ai le tele o galuega fa'ale-malo e fa'ata'ita'i ma au'ili'ili le fausaga o porotini.Ole maualuga ole malosi ole -23 kcal/mol po'o lalo ifo e fa'aalia ai le maualuga o le fibrillate.O le maualalo o le malosi o lona uiga e sili atu le mautu o le lua β-strands i le sipa conformation.E le gata i lea, o le Waltz algorithm na faʻaaogaina e vaʻai ai vaega amyloidogenic i NT, NTFlSp ma NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
O le vaifofo NT protein na faʻafefiloi ma le 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) paʻu i le pH 5.5 ma le 6.0 e faʻaititia ai le pH i le pH 6 ma le 7, i le faasologa.O le fa'ai'uga o le porotini mulimuli o le 100 mg/ml.
Fua na faia i luga o le J-1500 CD spectrometer (JASCO, ISA) faʻaaogaina le 300 μL cuvette faʻatasi ai ma se ala faʻapitoa o le 0.1 cm.O polotini sa fa'afefeteina ile 10 μM (n = 1) ile 20 mM phosphate buffer (pH 8).Ina ia au'ili'ili le mautu o le polotini i le i ai o le masima, sa su'esu'eina polotini i le fa'atonuga tutusa (n = 1) i le 20 mM phosphate buffer (pH 8) o lo'o iai le 154 mM NaF po'o le NaCl.O suʻesuʻega o le vevela na faʻamauina i le 222 nm mai le 25 ° C i le 95 ° C ma le vevela o le 1 ° C / min.O le fua faatatau o polotini gaugau fa'ale-natura na fa'atatau i le fua fa'atatau (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal).E le gata i lea, e lima spectra na faʻamauina mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi mai le 260 nm i le 190 nm i le 25 ° C ma a maeʻa faʻamafanafana i le 95 ° C.E lima alaleo na averesi, fa'alelei ma liua i molar ellipticity.Sa suʻesuʻeina faʻamatalaga e faʻaaoga ai le Prism 9.
O le malosi o le fluorescence o le His-NT-GFP (300 mg / mL, 80 μL) na fuaina i le tolu (n = 3) i 96-well Corning plates ma le pito i lalo o le lanu uliuli (Corning Glass 3881, USA) i lalo o tulaga masani.Fua faʻataʻitaʻiga faʻatasi ma le faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻasolosolo ma le umi o le galu o le 395 nm ma faʻamaumau le faʻamalo i le 509 nm aʻo leʻi faʻafefeteina ma le 2 itula mulimuli ane ile 37°C.Sa suʻesuʻeina faʻamaumauga i le Prism 9.
Purine nucleoside phosphorylase activity assay kit (fluorometric method, Sigma Aldrich) na faʻaaogaina e tusa ai ma faʻatonuga a le gaosiga.Ina ia fua le gaioiga i gels ma vaifofo o loʻo i ai His-NT-PNP, faʻafefiloi le 10 ng o le His-NT-PNP ma le 100 mg / mL NT i le aofaʻi atoa o le 2 µL ona o le gel na tuʻuina atu se faailo i luga aʻe o le vaʻaiga o le seti.Pulea mo gels ma fofo e aunoa ma Lana-NT-PNP na aofia ai.O fua na faia faalua (n = 2).Ina ua uma ona fuaina le gaioiga, ona aveese lea o le paluga o le tali ma pueina ata o le gel ina ia mautinoa o loʻo tumau pea le gel i le taimi o le fua.Sa suʻesuʻeina faʻamatalaga e faʻaaoga ai le Prism 9.
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i suʻesuʻega suʻesuʻega, vaʻai i le Natura suʻesuʻega faʻapitoa e fesoʻotaʻi ma lenei tusiga.
O ata 1 ma le 2 o loʻo faʻaalia ai faʻamatalaga muamua.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ma le 6, Ata Faaopoopo.3, mati faaopoopo.5a, d, mati faaopoopo.6 ma le mati faaopoopo.8. Fa'amatalaga Fa'amatalaga mai lenei su'esu'ega o lo'o fa'afeiloa'i ile Zenodo database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.O fa'amaumauga a le NMR na maua i lenei su'esu'ega na lafo i le fale teu oloa BMRbig i lalo ole fa'ailoga ID bmrbig36.O fausaga o le GFP ma le PNP na ave mai le PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Milo siliki apogaleveleve faafoliga.Vailaau Fa'amalo.biology.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.O le genome o le Nephila clavipes o loʻo faʻamaonia ai le eseesega o kenera silika apogaleveleve ma o latou faʻaaliga faigata.National Genette.49, 895–903 (2017).