Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O lo'o e fa'aogaina se su'esu'ega e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).E le gata i lea, ina ia mautinoa le lagolago faifaipea, matou te faʻaalia le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Fa'ase'e o lo'o fa'aalia tala e tolu ile fa'ata.Fa'aoga le pito i tua ma le isi ki e fa'asolo ai fa'ase'e, po'o fa'amau fa'ase'e i le pito e fa'asolo ai fa'ase'e ta'itasi.
347 Fa'amatalaga Pipa Uamea
347 12.7*1.24mm uamea uamea u'amea paipa
Vaitafe i fafo: 6.00 mm OD e o'o atu i le 914.4 mm OD, Tele e o'o atu i le 24” NB avanoa Ex-stock, OD Size Steel Tubes avanoa Ex-stock
SS 347 Va'aiga Mafiafia Paipa: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ma isi.
Ituaiga: SS 347 Su'ega Paipa |SS 347 ERW Paipa |SS 347 Paipa Uila |SS 347 Faiga Paipa |SS 347 CDW Pipa, LSAW Paipa / Su'isu'i / Toe tusia
Pepa: SS 347 Fa'aigoa Paipa / Fa'alava, SS 347 Square Paipa / Fa'apa'au, SS 347 Fa'aigoa Fa'apa'u / Fa'a'au, SS 347 Fa'a'au'au Fa'a'au, SS 347 "U" Fa'atusa, SS 347 Pan Kuki Coils, SS 347 Hydraulic Tubes
Umi: Fa'ailoga Tasi, Fa'ailoga Fa'alua & Fa'ai'uga Mana'omia Umi: Fa'ai'uga Fa'alano, Fa'ai'uga Fa'a'au, Ta'atia
Puipuiga Fa'ai'u: Pupuni Palasitika |Faʻaiʻuga i fafo: 2B, Nu.4, Nu.1, Nu.8 Faʻata Faʻauma mo Paipa Uamea Umea, Faʻauma e tusa ai ma manaʻoga o tagata faʻatau.
Tulaga tu'uina atu: Fa'amau ma Pi'i, Fa'aiila, Fa'amalama Fa'amalama, Toso Malili
Su'esu'ega, Lipoti Su'ega: Tusi Fa'amaonia Su'ega Mill, EN 10204 3.1, Lipoti Vailaau, Lipoti Fa'ainisinia, Lipoti Su'ega a le PMI, Lipoti Va'ai Va'aiga, Lipoti Su'esu'ega Tolu, Lipoti Fa'amaonia a le NABL, Lipoti Su'ega Fa'aleagaina, Lipoti Su'ega Le Fa'aleagaina
Fa'aputuina: Fa'aputu i Pusa La'au, ato palasitika, fa'amea u'amea fa'apipi'i, po'o le fa'atonuga a tagata fa'atau.
Faʻapitoa: Laʻoa ma Faʻamatalaga e ese mai i luga e mafai ona gaosia i luga ole talosaga
SS 347 Fua o le Paipa: 1/2 inisi NB, OD i le 24 inisi
ASTM A312 347: Pipa austenitic u'u sa'o ma su'i sa'o e fa'amoemoe mo le maualuga o le vevela ma le fa'a'au'au masani.E le fa'atagaina u'amea fa'atumu i le taimi o le uelo.
ASTM A358 347: Fa'afefiloi fa'aeletise fa'apipi'i austenitic paipa mo 'au'aunaga fa'aleaga ma/po'o le vevela maualuga.E masani lava na'o le paipa e o'o i le 8 inisi e gaosia i lenei fa'amatalaga.E fa'atagaina le fa'aopoopoina o u'amea fa'atumu i le taimi o le uelo.
ASTM A790 347: Pipa ferritic/austenitic (duplex) ua fa'amoemoeina mo auaunaga fa'a'ele'ele lautele, fa'atasi ai ma le fa'amamafa fa'apitoa i le tete'e atu i le fa'amamafa o le ta'e.
ASTM A409 347: Su'isu'i sa'o po'o le su'isu'i-su'i eletise fusu'aga ua u'uina le lautele austenitic moli puipui paipa i lapopo'a 14" i le 30" ma puipui Sch5S ma Sch 10S mo pala ma/po'o maualuga.
ASTM A376 347: Pipa austenitic le lelei mo le maualuga o le vevela.
ASTM A813 347: Su'isu'i tasi, paipa austenitic fa'apipi'i tasi pe fa'alua mo le vevela maualuga ma fa'aogaina lautele.
ASTM A814 347: O le paipa austenitic faʻafefete faʻafefe mo le maualuga o le vevela ma le faʻaogaina lautele.
347H paipa uamea uamea fa'ameamea
| Vasega | C | Mn | Si | P | S | Cr | Mo | Ni | N | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 347H | min. | 0.04 | – | – | – | – | 17.0 | 3.00 | 9.0 | – |
| maualuga. | 0.10 | 2.0 | 1.00 | 0.045 | 0.030 | 19.0 | 4.00 | 13.0 | – | |
Uamea uamea 347H Pipe Mechanical Properties
| Vasega | Malosi Tetele (MPa) min | Malosi e maua 0.2% Fa'amaoniga (MPa) min | Elongation (% i le 50mm) min | Malosi | |
|---|---|---|---|---|---|
| Rockwell B (HR B) maualuga | Brinell (HB) maualuga | ||||
| 347H | 515 | 205 | 40 | 92 | 201 |
Uamea uamea 347H Pipes Meatotino Faaletino
| Vasega | Malosi (kg/m3) | Elastic Modulus (GPa) | Ole Fa'atatau ole Fa'ateleina ole vevela (m/m/0C) | Amioga vevela (W/mK) | Vevela Fa'apitoa 0-1000C (J/kg.K) | Tete'e eletise (nm) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0-1000C | 0-3150C | 0-5380C | i le 1000C | i le 5000C | |||||
| 347H | 8000 | 193 | 17.2 | 17.8 | 18.4 | 16.2 | 21.5 | 500 | 720 |
Fa'ailoga Tutusa mo le 347H Pipa Uamea
| Vasega | UNS Nu | Peretania tuai | Euronorm | Suetena SS | Iapani JIS | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| BS | En | No | Igoa | ||||
| 347H | S34709 | – | – | 1.4961 | – | – | – |
| Tulaga | Tofiga |
| ASTM | A 312 |
|---|---|
| ASME | SA 312 |
Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation ose fa'ailoga o le ma'i o Parkinson ma isi synucleinopathies.Talu ai nei, o le tau protein e masani ona fesoʻotaʻi ma le faʻamaʻi o le Alzheimer ua fesoʻotaʻi ma le αS pathology ma maua ai le faʻaogaina i totonu o le αS-oaʻoa, e ui o le molecular mechanism of coaggregation of the two proteins e tumau pea le le manino.Matou te lipoti atu iinei o le vaega o le αS o loʻo vaʻavaʻavaʻa i faʻamaʻi vai e ala i le faʻalavelave faʻalavelave eletise faʻatasi ma polypeptides faʻamalosia lelei e pei ole tau.Faʻalagolago i le vavalalata o le αS mo polycations ma le fua o le valence depletion o le coagulation network, clots maua vave gelation po o coalescence sosoo ai ma le faʻagesegese amyloid aggregation.E ala i le tuʻufaʻatasia o se faʻasologa o metotia faʻapitoa faʻaola, na mafai ai ona matou faʻamalamalamaina le vaeluaga o le αS/Tau vai-suavai ma faʻailoa mea taua e taʻitaʻia ai le faʻavaeina o aggregates eseese o loʻo i ai uma polotini i totonu o le condensate protein vai.
I le faaopoopo atu i vaega o le membrane, e mafai foi ona ausia le vavaeeseina o avanoa i totonu o sela e ala i le fausia o ni polotini-maua, vai-pei o le tino mafiafia e taʻua o le biomolecular condensates po o matāua, e ala i se faagasologa ua taʻua o le vai-suavai vaega vavaeesega (LLPS).O nei matāua e fausia e fegalegaleaiga fa'aletino e tele, e masani lava i le va o polotini po'o polotini ma le RNA, ma e tele galuega fa'atino i le toetoe lava o mea ola uma.O se numera tele o polotini e mafai ona gafatia e LLP o loʻo faʻaalia ai faʻasologa o le lavelave maualalo e matua faʻaleagaina i le natura ma le faʻavaeina o condensates biomolecular3,4,5.O le tele o suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga ua faʻaalia ai le fetuutuunai, e masani ona le mautonu, ma le tele o le natura o polotini e fausia ai nei condensates pei o le vai, e ui lava e itiiti se mea e iloa e uiga i mea faʻapitoa mole mole e pulea le tuputupu aʻe ma le matua o nei condensates i se sili atu le malosi. setete..
O fa'amaumauga fou o lo'o lagolagoina ai le manatu e fa'apea, o le LLPS e fa'aosoina le polotini aberrant ma le fa'aliliuina o matāua i totonu o fausaga mautu e ono avea ma ala feavea'i talafeagai e ta'ita'i atu ai i le fa'atupuina o fa'aputuga oona e le mafai ona fa'asusu lea e masani ona fa'ailogaina o fa'ama'i degenerative.O le tele o LLPS e fesoʻotaʻi ma faʻalavelave faʻalavelave faʻalavelave (IDPs), e masani ona maualuga le molia ma fetuutuunai, ua leva ona fesoʻotaʻi ma le neurodegeneration e ala i le faagasologa o le amyloid aggregation.Aemaise lava, biomolecular IDP condensates e pei o le FUS7 poʻo le TDP-438 poʻo polotini ma laʻititi lavelave lavelave domains e pei o le hnRNPA19 ua faʻaalia le matua i gel-pei poʻo foʻi malosi e ala i se faʻagasologa e taʻua o le fluidization.fa'atasi.i le suiga vaega mautu (LSPT) e fai ma galuega o le taimi po'o le tali atu i nisi o suiga pe a mae'a fa'aliliuga po'o suiga taua ole pathologically1,7.
O le isi IDP e fesoʻotaʻi ma le LLPS i vivo o Tau, o le microtubule-associated disordered protein o lona amyloid aggregation ua aʻafia i le faʻamaʻi o le Alzheimer10 ae talu ai nei na aʻafia ai i le maʻi o Parkinson (PD) ma isi synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 e fesoʻotaʻi.O Tau ua fa'aalia e tete'a fa'afuase'i mai le vaifofo/cytoplasm ona o feso'ota'iga fa'aeletise lelei14, ma i'u ai i le fa'atupuina o matāua fa'atamaoaigaina tau ua ta'ua o le electrostatic coacervates.Ua maitauina foi o lenei ituaiga o fegalegaleai e le patino o le malosi lea e mafua ai le tele o condensates biomolecular i le natura15.I le tulaga o se polotini tau, e mafai ona fausia le tuufaatasiga electrostatic e ala i le tuufaatasiga faigofie, lea o loʻo faʻafeagai le molia o itulagi o le polotini e faʻaosoina ai le faʻagasologa o le cleavage, poʻo le faʻalavelave faʻapipiʻi e ala i fegalegaleaiga ma polymers leaga e molia e pei ole RNA.
Talu ai nei, o le α-synuclein (αS), o le amyloid IDP o loʻo aʻafia i le PD ma isi faʻamaʻi neurodegenerative faʻapitoa e taʻua o le synucleinopathy17,18, ua faʻaalia i le telefoni feaveaʻi ma manu faʻataʻitaʻiga19,20 faʻapipiʻi i le protein condensates ma le amio e pei o le vai.O suʻesuʻega in vitro ua faʻaalia ai o le αS e maua i le LLPS e ala i le faʻapipiʻiina faigofie e ala i le tele o fegalegaleaiga hydrophobic, e ui lava o lenei faagasologa e manaʻomia ai le maualuga o le protein concentrations ma le umi o le taimi o le incubation19,21.Pe o le condensates o loʻo i ai le αS o loʻo matauina i vivo o loʻo fausia e lenei poʻo isi faiga LLPS e tumau pea o se mataupu autu e leʻi foia.E faapena foi, e ui lava o le αS amyloid aggregation ua matauina i neurons i le PD ma isi synucleinopathies, o le auala tonu lea e maua ai e le αS le intracellular amyloid aggregation e tumau pea le le manino, ona o le faʻaalia o lenei porotini e foliga mai e le faʻaosoina lenei faiga na o ia.E masani ona manaʻomia le faʻaleagaina o le telefoni feaveaʻi, e taʻu mai ai e manaʻomia nisi nofoaga feaveaʻi poʻo microenvironments mo le toe faʻaleleia o faʻapotopotoga αS amyloid intracellular.O le tasi si'osi'omaga fe'avea'i e fa'apitoa ona fa'aputu'e atonu o totonu ole polotini condensates 23 .
O le mea e malie ai, o le αS ma le tau ua maua e faʻapipiʻi faʻatasi i faʻamaʻi faʻamaʻi i totonu o tagata e maua i le maʻi o Parkinson ma isi synucleinopathies 24,25 ma faʻataʻitaʻiga ua lipotia mai ai se fesoʻotaʻiga faʻapitoa i le va o polotini e lua 26,27 o loʻo fautua mai ai se fesoʻotaʻiga i le va o le tuufaatasiga αS ma tau i fa'ama'i neurodegenerative.gasegase.αS ma tau ua maua e fegalegaleai ma faʻalauteleina le faʻapipiʻiina o le tasi i le isi i vitro ma i vivo 28,29 ma faʻalapotopotoga eseese e aofia ai nei polotini e lua ua matauina i le faiʻai o tagata mamaʻi ma synucleinopathies 30.Ae ui i lea, e itiiti se mea e iloa e uiga i le faʻavae mole o le fegalegaleaiga i le va o le αS ma le tau ma le faiga o lona faʻatasi.Ua lipotia mai e fegalegaleai le αS ma le tau e ala i se tosinaga eletise i le va o le vaega C-terminal e sili ona leaga le tauina o le αS ma le vaega mauoa o le proline tutotonu o le tau, lea e faatamaoaigaina foi i toega lelei.
I lenei suʻesuʻega, matou te faʻaalia ai e mafai e le αS ona vavae ese i matāua e ala i le condensation lavelave electrostatic i le i ai o le protein tau, e ese mai i ana fegalegaleaiga ma isi polypeptides e molia lelei e pei ole poly-L-lysine (pLK), ma i lenei faagasologa.O le αS e galue e pei o se mole mole mole matāua.Ua matou iloa ni eseesega iloga i le faagasologa o le matua o le electrostatic αS coacervates, lea e fesootaʻi ma eseesega i le valency ma le malosi o le fegalegaleaiga o porotini o loʻo aʻafia i le fesoʻotaʻiga coacervate.O le mea e malie ai, na matou matauina le faʻapipiʻiina o polotini αS ma tau amyloid i faʻamaʻi vai ola umi ma faʻamaonia nisi o mea taua e taʻitaʻia ai le tuufaatasia o nei polotini e lua i ia coacervates.O iinei matou te faʻamatalaina auiliili ai lenei faagasologa, o se masini mole mole e mafai ona faʻavaeina le colocalization o polotini e lua i faʻamaʻi faʻapitoa faʻamaʻi.
O le αS o loʻo i ai se siʻusiʻu C-terminal maualuga maualuga i le pH le mautonu (Fig. 1a), ma na matou faʻapea e mafai ona oʻo i le LLPS e ala i le condensation o faʻalavelave eletise faʻatasi ma polycationic disordered polypeptide molecules.Na matou faʻaaogaina le 100-residue poly-L-lysine (pLK) e avea ma mole faʻataʻitaʻiga amata ona o lona faʻamalosia lelei ma le faʻaleagaina o le natura o le polymeric i le pH neutral 32. Muamua, matou faʻamaonia o le pLK e fegalegaleai ma le Ct domain o le αS e ala i le Solution NMR spectroscopy. (Ata 1b) fa'aaoga le 13C/15N-fa'ailoga αS i luma o le fa'ateleina o le αS:pLK molar ratios.O le fegalegaleaiga a le pLK ma le Ct-domain o le αS o loʻo faʻaalia i le faʻalavelave o le suiga o vailaʻau ma le faʻaitiitia o le maualuga o le malosi i lenei itulagi o le porotini.O le mea e malie ai, pe a matou faʻafefiloi le αS ma le pLK i se faʻatonuga αS e tusa.5-25 µM i le i ai o le polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (fa'apena LLPS masani: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) na vave ona matou ui atu i se lautele lautele o le fausiaina o polotini. .sa mata'utia matāua i le fa'aogaina o le fa'amalama (WF) ma le fa'amalamalamaga (BF) microscopy (Ata 1c).1-5 µm droplets o loʻo i ai le αS faʻapitoa (faʻaopoopo 1 μM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), o latou mea eletise e mafai ona maua mai i lo latou tetee atu i le 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ma lona lagona se faʻaopoopoga o le faʻaogaina o le NaCl (Ata 1c).O le natura pei o le sua o le coacervates o le αS / pLK electrostatic complex o loʻo faʻaalia i lo latou gafatia e faʻafefiloi i totonu ole milliseconds (Fig. 1d).I le faʻaaogaina o le turbidimetry, matou te faʻatusatusaina le faʻavaeina o matāua i lalo o nei tulaga, faʻamaonia le natura eletise o le fesoʻotaʻiga autu e fesoʻotaʻi ma lona mautu (Fig. 1e), ma iloilo le aʻafiaga o fua faʻatatau polymer i le faagasologa o le LLPS (Fig 1f).E ui o le fa'atupuina o le matāua o lo'o va'aia i luga o le tele o fa'atusatusaga polymer, o le fa'agasologa e sili ona lelei pe a sili atu le pLK i le αS.O lo'o matauina foi LLP i le fa'aaogaina o le vaila'au fa'ate'a ese dextran-70 (70 kDa) po'o le fa'aogaina o fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga, e aofia ai matā'a tioata, vaieli microplate o mea 'ese'ese, Eppendorf po'o quartz capillaries.
se faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o itulagi porotini eseese i le WT-αS ma le ΔCt-αS faʻaogaina faʻaoga i lenei suʻesuʻega.O le amphipathic N-terminal domain, o le hydrophobic amyloid-forming (NAC) region, ma le C-terminal domain e le lelei ona molia o loʻo faʻaalia i le lanumoana, moli, ma le mumu.O loʻo faʻaalia le faʻafanua Net Charge Per Residual (NCPR) o le WT-αS.b suʻesuʻega NMR o le fesoʻotaʻiga αS / pLK i le leai o ni faʻalavelave macromolecular.A'o fa'atuputeleina le fa'atuputeleina o le pLK (αS:pLK molar ratios o le 1:0.5, 1:1.5, ma le 1:10 o lo'o fa'aalia i le lanumeamata lanumeamata, lanumeamata, ma le lanumeamata uliuli, fa'asologa).c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) i le 25 µM (1 µM AF488-labeled αS po o le Atto647N-labeled pLK mo WF imaging) i le LLPS buffer (pito i luga) pe faaopoopo i le 500 mM NaCl (lalo agavale) pe a uma le 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; pito i lalo taumatau).Fua fua = 20 µm.d Fa'atusa ata fa'ata'oto o le BF droplet fusion o le αS/pLK (molar ratio 1:10) i le fa'atonuga o le 25 μM;o aū e fa'ailoa mai ai le tu'ufa'atasia o matau'a ta'itasi (aū mumu ma samasama) i se matau'a fou (au moli) i totonu ole 200 ms).Fua fua = 20 µm.e Fa'asalalauina le malamalama (i le 350 nm) αS/pLK fa'aputuga i le LLPS pa'u a'o le'i fa'aopoopoina le 500 mM NaCl po'o le 10% 1,6-HD ile 25 µM αS (N = 3 fa'ata'ita'iga fa'atusa, uiga ma le fa'asologa masani o lo'o fa'aalia foi).f BF ata (pito i luga) ma suʻesuʻega faʻasalalau malamalama (i le 350 nm, pito i lalo) o le αS / pLK aggregation i le 25 μM αS faʻatasi ai ma le faʻateleina o le αS: pLK molar ratio (N = 3 faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, uiga ma le faʻasologa masani o loʻo faʻaalia foi).Fua fua = 10 µm.Ole fua fa'atatau ile ata e tasi e fa'ailoa mai ai le fua o ata uma ile laulau e tasi.O faʻamatalaga mataʻutia e tuʻuina atu i foliga o faila faʻamaumauga mataʻutia.
Faʻavae i luga oa matou faʻamatalaga o le αS / pLK electrostatic complex condensation ma faʻamatalaga muamua o le αS o se mole mole o le tau / RNA condensate e ala i fegalegaleaiga tuusaʻo ma le tau31, matou te manatu e mafai e le αS ma le tau ona tuʻufaʻatasia ma le solvent pe a leai se RNA. condensation.e ala i lavelave eletise, ma o le αS o le porotini scaffold i αS/Tau coacervates (vaai tau tufatufa tau i le Ata 2e).Na matou matauina pe a faʻafefiloi le 10 μM αS ma le 10 μM Tau441 (o loʻo i ai le 1 μM AF488-αS ma le 1 μM Atto647N-Tau) i le LLPS paʻu, e faigofie ona latou faia ni polotini aggregates o loʻo i ai uma polotini, e pei ona vaʻaia e le WF microscopy.(Ata 2a).O le colocalization o polotini e lua i totonu o matāua na faʻamaonia e confocal (CF) microscopy (Faʻaopoopo Ata 1a).O amioga faʻapena na matauina pe a faʻaaogaina le dextran-70 e fai ma sui faʻapipiʻi (Faʻaopoopo Ata 1c).I le faʻaaogaina o le FITC-faʻailoga PEG poʻo le dextran, na matou iloa ai o loʻo tuʻufaʻatasia uma sui faʻapipiʻi i luga o faʻataʻitaʻiga, e le faʻaalia ai le vavaeeseina poʻo le faʻatasi (Faʻaopoopo Ata 1d).Nai lo lena, o loʻo fautua mai i totonu o lenei faiga latou te faʻalauiloaina le vavaeeseina o vaega e ala i aʻafiaga o le tumutumu o le macromolecular, talu ai o le PEG o se sui faʻapipiʻi mautu, e pei ona vaaia i isi faiga LLP33,34.O nei matāua mauoa i polotini na maaleale i le NaCl (1 M) ae le o le 1,6-HD (10% v / v), faʻamaonia a latou mea eletise (Faʻaopoopo Ata 2a, b).Na fa'amaonia a latou amio i le va'ava'ai i le millisecond merge droplet mea tutupu e fa'aaoga ai le BF microscopy (Fig. 2b).
a Confocal (CF) microscopy ata o le αS/Tau441 coacervates i LLPS buffer (10 μM o porotini taitasi, 0.5 μM o AF488-igoa αS ma Atto647N-igoa Tau441).b Fa'atusa fa'alavelave fa'alavelave (DIC) fa'atusa fa'atusa o mea tutupu fa'afefiloi αS/Tau441 (10 μM mo porotini ta'itasi).c Fa'afanua fa'avae e fa'atatau i le fa'ata'ape'apeina o le malamalama (i le 350 nm) o Tau441 LLPS (0–15 µM) i le toesea (agavale) po'o le i ai (taumatau) o le 50 µM αS.O lanu mafanafana e faʻaalia ai le tele o faʻasalalauga.d Faʻataʻapeʻapeina malamalama o faʻataʻitaʻiga αS / Tau441 LLPS faʻatasi ai ma le faʻateleina o le faʻaogaina o le αS (Tau441 i le 5 μM, N = 2-3 faʻataʻitaʻiga toe fai e pei ona faʻaalia).e Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o nisi suiga tau polotini ma vaega 'ese'ese o le porotini o lo'o fa'aaogaina i lenei su'esu'ega: N-terminal domain (lanu mumu), proline-rich region (lanumoana), microtubule-binding domain (MTBD, fa'ailoa i le moli), ma ta'amilosaga taitoalua e fai amyloid.itulagi filament (PHF) o lo'o i totonu ole MTBD (efuefu).O lo'o fa'aalia le fa'afanua Net Charge Per Residue (NCPR) o le Tau441.f Fa'aaogā le 1 µM AF488-fa'ailoga αS ma le Atto647N-fa'ailoga ΔNt-, fa'aaoga le 1 μM AF488-fa'ailoga αS po'o le ΔCt-αS i luma ole ΔNt-Tau (pito i luga, 10 μM i le porotini) po'o le K18 (lalo, 50 µM ) ) ) micrographs o le WF ua fa'aputu i le LLPS po'o le K18 pa'u.O fua fa'amau i le ata e tasi o lo'o fa'atusalia ai le fua o ata uma i le laulau e tasi (20 µm mo panela a, b ma le f).O fa'amatalaga mata'utia mo paneli c ma le d o lo'o tu'uina atu e fai ma faila fa'amaumauga mata'utia.
Ina ia faʻataʻitaʻiina le matafaioi a le αS i lenei faiga LLPS, na matou suʻesuʻeina muamua le aafiaga o le αS i luga o le faʻamautu o le paʻu e ala i le nephelometry e faʻaaoga ai le faʻateleina o le NaCl (Fig. 2c).O le maualuga o le masima i totonu o faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le αS, o le maualuga o le faʻasalalauina o le malamalama (i le 350 nm), lea e faʻaalia ai le faʻamautuina o le αS i lenei faiga LLPS.E mafai ona matauina se aafiaga faapena e ala i le faateleina o le αS concentration (ma o lea o le αS:Tau441 ratio) i le approx.Fa'a-10 fa'atupuina fa'atatau i le tau (5 µM) (Ata 2d).Ina ia faʻaalia o le αS o se porotini faʻapipiʻi i coacervates, na matou filifili ai e suʻesuʻe le amio a le LLPS-faʻalavelave Tau mutant, lea e leai se N-terminal e faʻaleagaina (toega 1-150, vaʻai Ata 2e) taʻua ΔNt-Tau.O le WF microscopy ma le nephelometry na faʻamaonia ai o le ΔNt-Tau lava ia e leʻi oʻo i le LLPS (Fig. 2f ma le Faʻaopoopo Fig. 2d), e pei ona lipotia muamua 14. Ae ui i lea, ina ua faʻaopoopoina le αS i fofo faʻasalalau o lenei suiga Tau tipi, o le faagasologa o le LLPS na atoatoa. toe fa'afo'i fa'atasi ma le ma'atā matāua latalata i le matā'ele o vaifofo lapopo'a o Tau ma le αS i lalo o tu'utu'uga tutusa ma le fa'aputuga o porotini.O lenei faagasologa e mafai foi ona matauina i lalo o tulaga o le maualalo macromolecular tumutumu (Faaopoopo Ata. 2c).O le matafaioi a le C-terminal αS region, ae le o lona umi atoa, i le LLPS process na faʻaalia e ala i le taofiofia o le faʻavaeina o le matāua e faʻaaoga ai le C-terminal truncated αS variant leai ni toega 104-140 (Fig. 1a) o le (ΔCt- αS) porotini (Fig. 2f ma le Fig. 2d Faaopoopo).O le faʻaogaina o le αS ma le ΔNt-Tau na faʻamaonia e le microscopy fluorescence confocal (Faʻaopoopo Ata 1b).
Ina ia faʻataʻitaʻi atili le masini LLPS i le va o le Tau441 ma le αS, na faʻaaogaina ai se isi suiga Tau, e taʻua o le vaega o le helical filament core (PHF) faʻapipiʻiina i le microtubule-binding domain (MTBD), lea afai e aofia ai vaega e fa toe fai, e masani ona iloa. e pei o le K18 fragment (silasila i le Ata 2e).Na lipotia talu ai nei e sili atu le fusifusia o le αS i se porotini tau o loʻo i totonu o se vaega mauoa proline i se faʻasologa e muamua atu i le microtubule-binding domain.Ae ui i lea, o le itulagi o le PHF e mauoa foi i toega lelei (silasila i le Ata 2e), aemaise le lysine (15% toega), lea na mafua ai ona matou suʻeina pe o lenei itulagi foi e saofagā i le condensation o le αS / Tau faʻalavelave.Na matou matauina o K18 na o ia e le mafai ona faʻaosoina le LLPS i faʻasalalauga e oʻo atu i le 100 μM i lalo o tulaga faʻataʻitaʻiina (LLPS paʻu ma le 15% PEG poʻo le 20% dextran) (Ata 2f).Ae ui i lea, ina ua matou faʻaopoopoina le 50 μM αS i le 50 μM K18, o le vave faʻavaeina o matāua porotini o loʻo i ai K18 ma le αS na matauina e nephelometry (Faʻaopoopo Ata 2d) ma WF microscopy (Fig. 2f).E pei ona faʻamoemoeina, na le mafai e le ΔCt-αS ona toe faʻafoʻi le amio LLPS o K18 (Fig. 2f).Matou te maitauina o le tuufaatasiga o le αS / K18 e manaʻomia ai le maualuga o le protein concentrations e faʻaosofia ai le LLPS pe a faʻatusatusa i le αS / ΔNt-Tau poʻo le αS / Tau441, o isi mea e tutusa.O loʻo ogatasi lea ma se fegalegaleaiga malosi o le αS C-terminal region ma le proline-rich Tau domain pe a faʻatusatusa i le microtubule-binding domain, e pei ona faʻamatalaina muamua 31.
Talu ai e le mafai e le ΔNt-Tau ona faia le LLPS i le leai o le αS, na matou filifilia lenei Tau e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le faʻamalamalamaina o le αS / Tau LLPS ona o lona faigofie i LLPS faiga ma Tau atoa (isotype, Tau441 / Tau441).fa'atasi ai ma faiga fa'apipi'i lavelave (heterotypic, αS/Tau441).Na matou faʻatusatusaina le tikeri o le αS aggregation (o se vaega o le porotini vaega condensed, fαS, c) i le αS / Tau ma le αS / ΔNt-Tau faiga e centrifugation ma faʻasalalau vaega SDS-PAGE suʻesuʻega (vaʻai 2e), maua tutusa tulaga tutusa. mo polotini uma i le fa'atonuga tutusa.Aemaise lava, na matou mauaina le fαS,c 84 ± 2% ma le 79 ± 7% mo le αS/Tau ma le αS/ΔNt-Tau, e taʻu mai ai e sili atu le fegalegaleaiga i le va o le αS ma le tau nai lo le fegalegaleaiga i le va o mole tau.va.
O le fegalegaleaiga ma polycations eseese ma le aafiaga o le condensation process i luga o le αS kinetics na muamua suʻesuʻeina e le fluorescence toe faʻaleleia pe a uma le photobleaching (FRAP) metotia.Na matou suʻeina αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ma αS / pLK faʻatasi (100 μM αS faʻaopoopo i le 2 μM αS AF488-αS ma le 100 μM Tau441 poʻo le ΔNt-Tau poʻo le 1 mM pLK).Na maua faʻamatalaga i totonu ole 30 minute muamua pe a maeʻa le faʻafefiloi o vaega faʻataʻitaʻiga.Mai ata FRAP sui (Fig. 3a, αS/Tau441 condensation) ma o latou taimi fa'asologa o taimi (Fig. 3b, Fa'aopoopo Fig. 3), e mafai ona iloa o le αS kinetics e tutusa lelei ma Tau441 coacervates.ma le ΔNt-Tau, lea e sili atu le vave ma le pLK.O fa'asologa fa'asalalau fa'atatau mo le αS i totonu o le coacervate e tusa ai ma le FRAP (e pei ona fa'amatalaina e Kang et al. 35) o le D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ma le D = 0.026 ± 0.008 µm2/s mo αS/TauS441 ma le αS/TauS441. le αS/ faiga.pLK, Tau, ma D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, i le faasologa (Ata 3c).Ae ui i lea, o le diffusion coefficient αS i le vaega faʻasalalau e tele faʻatonuga o le maualuga e maualuga atu nai lo vaega faʻapipiʻi uma, e pei ona fuafuaina e le Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, vaʻai Faʻaopoopo Fig. 3) i lalo o tulaga tutusa (LLPS buffer) ae i le leai o polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).O le mea lea, o le kinetics o le αS faaliliuga e matua faʻaititia i coacervates pe a faʻatusatusa i polotini i le vaega faʻasalalau ona o le faʻalauiloaina o aʻafiaga mole mole, e ui lava o coacervates uma o loʻo taofiofia mea e pei o le vai i le afa itula muamua talu ona latou faʻavaeina, e faʻatusatusa i le vaega tau.kinetics vave i pLK condensate.
a-c FRAP suʻesuʻega o le αS dynamics (2% AF488-labeled αS) i electrostatic coacervates.O ata fa'atusa o su'esu'ega a le αS/Tau441 FRAP i fa'atolu o lo'o fa'aalia i le (a), lea e fa'ailoa mai ai e li'o mumu ni vaega ua fa'aleaga.Ole fua ole pa ole 5 µm.e avefeau pupuni FRAP ma (c) fa'atatau fa'asoa fa'atasi (D) mo le 5-6 (N) matāua 'ese'ese mai fa'ata'ita'iga e tolu e fa'aaoga ai le 100 µM αS ma fa'aputuga tutusa o Tau441 (mumu) po'o le ΔNt-Tau (lanu moana) po'o le pLK (lanumeamata) i le sefulu taimi le faʻatonuga o le LLPS.O le va'aiga masani o le FRAP curve o lo'o fa'aalia ile lanu paolo.Mo le faʻatusatusaga, o le faʻasalalauga faʻasalalau αS i le vaega faʻasalalau na faʻamoemoeina i faʻatolu e faʻaaoga ai le felafolafoaʻi faʻatasi (FCS) (silasila i le Ata Faʻaopoopo 3 ma metotia mo nisi faʻamatalaga).d Fa'aauau X-band EPR spectra o le 100 μM TEMPOL-122-αS i le LLPS buffer e aunoa ma se polycation (uliuli) po'o le i ai o le 100 μM Tau441 (mumu) po'o le ΔNt-Tau (lanu moana) po'o le 1 mM pLK (lanu meamata).O loʻo faʻaalia e le faʻapipiʻi se vaaiga faʻalauteleina o laina malosi o le fanua lea e tupu ai suiga sili ona mataʻutia.e fusifusia pupuni o le 50 μM TEMPOL-122-αS ma polycations eseese i le leai o LLPS (leai PEG).O le fa'aitiitia o le fa'aitiitiga o le vaega III pe a fa'atusatusa i le fusi II (IIII/III) o le alaleo o le EPR masani o lo'o fa'aalia e fa'ateleina ai le molar ratio o Tau441 (mumu), ΔNt-Tau (lanu moana) ma le pLK (lanu meamata).O laina felanulanua'i e fa'aalia le fetaui i fa'amaumauga e fa'aaoga ai se fa'ata'ita'iga fusifusia ma ni nofoaga fa'apipi'i tutusa ma tuto'atasi i pi'oga ta'itasi.O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.
I le avea ai o se faʻaopoopoga, na matou suʻesuʻeina le malosi o le αS i coacervates eseese e faʻaaoga ai le faʻailoga faʻataʻitaʻiga (SDSL) ma le faʻaauau pea o le electron paramagnetic resonance (CW-EPR).O lenei metotia ua faʻamaonia e aoga tele i le lipotia o le fetuutuunai ma le faʻamalosia o le IDP faʻatasi ai ma se faʻamatalaga faʻamalo moni36,37,38.I lea tulaga, na matou fausia ai le cysteine residues i le tasi Cys mutants ma faʻaaogaina le 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin suʻesuʻe.Maleimide derivatives igoa ia i latou.Aemaise lava, na matou faʻaofiina suʻega TEMPOL i le tulaga 122 poʻo le 24 αS (TEMPOL-122-αS ma TEMPOL-24-αS).I le tulaga muamua, matou te taulaʻi i le C-terminal eria o le porotini, lea e aʻafia i fegalegaleaiga ma polycations.Nai lo lena, o le tulaga 24 e mafai ona tuʻuina mai ia i tatou faʻamatalaga e uiga i le aotelega o le malosi o polotini i le condensate.I tulaga uma e lua, o faʻailoga EPR na maua mo polotini o le vaega faʻasalalau e fetaui ma faʻamaʻi nitroxide i le tulaga televave.A maeʻa le vavaeesega i le i ai o le tau poʻo le pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 poʻo le ΔNt-Tau i le fua faatatau o le 1: 1 poʻo le pLK i le fua faatatau o le 1:10), o se faʻaopoopoga o le maualuga maualuga na matauina i totonu. ole alaleo ole EPR ole αS.O le laina leiloa ua faʻalauteleina, faʻaalia ai le faʻaitiitia o le αS reorientation kinetics i droplets pe a faʻatusatusa i le porotini i le vaega faʻafefe (Fig. 3d, Faʻaopoopo Ata 4a).O nei suiga e sili atu ona faʻaalia i le tulaga 122. Aʻo i le tulaga 24 o le i ai o le pLK e leʻi aʻafia ai le kinetics o le suʻega, i le tulaga 122 o le foliga o le laina faʻaaliga na suia tele (Faʻaopoopo Ata 4a).Ina ua matou taumafai e faʻataʻitaʻi le spectra i le tulaga 122 o lua αS / polycation system e faʻaaoga ai le faʻataʻitaʻiga isotropic (Ata Faʻaopoopo 5a) e masani ona faʻaaogaina e faʻamatala ai le malosi o le IDP38,39, ua le mafai ona matou toe faʻaleleia le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga..Fa'ata'ita'iga fa'apitoa o le tulaga o 24 vili fa'atusatusa (Fa'aopoopo Ata 5a).O lo'o ta'u mai ai o lo'o i ai tulaga fa'apitoa i le avanoa o fa'asologa o le vili o le vaega C-terminal o le αS i le i ai o polycations.Pe a mafaufau i le vaega o le αS i le vaega condensed i lalo o tulaga faataitai EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, ma 47 ± 4% mo αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, ma le αS/pLK, faasologa-vaai Faaopoopo. Ata 2e o faʻamatalaga faʻamatalaga c), e mafai ona iloa o le faʻalauteleina o loʻo iloa e le auala EPR e faʻaalia ai le fegalegaleaiga o le C-terminal itulagi o le αS ma polycations eseese i le vaega condensed (o le suiga autu pe a faʻaaoga TEMPOL-122- αS), ae le o le palatini condensation.O lo'o maitauina le fa'ateleina ole microviscosity ile su'esu'ega.E pei ona faʻamoemoeina, o le fusi o le EPR o le polotini i lalo o tulaga e ese mai i le LLPS na toe faʻafoʻi atoatoa pe a faʻaopoopo le 1 M NaCl i le paluga (Faʻaopoopo Ata 4b).I le aotelega, o matou faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o suiga na maua e le CW-EPR e faʻaalia ai le fegalegaleaiga o le C-terminal eria o le αS ma polycations eseese i le vaega condensed, ma o lenei fegalegaleaiga e foliga mai e sili atu le malosi ma le pLK nai lo Tau.
Ina ia maua nisi faʻamatalaga faʻavae e uiga i polotini i le coacervate, na matou filifili e suʻesuʻe le LLPS system e faʻaaoga ai le NMR i le fofo.Ae ui i lea, e mafai ona matou iloa naʻo le vaega αS o loʻo totoe i le vaega faʻasalalau, atonu e mafua ona o le faʻaitiitia o le malosi o le polotini i totonu o le coacervate ma se vaega mafiafia i le pito i lalo ole fofo ile suʻesuʻega NMR.Ina ua matou suʻesuʻeina le fausaga ma le malosi o le polotini o loʻo totoe i le vaega faʻasalalau o le LLPS faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai le NMR (Faʻaopoopo Ata. 5c, d), na matou matauina o le polotini na amio toetoe lava tutusa i le i ai o le pLK ma le ΔNt-Tau, e lua. lea sa i totonu o le fausaga lona lua ma le malosi o le porotini tua, faʻaalia e suʻesuʻega i le suiga lona lua o vailaʻau ma le R1ρ malolo.O faʻamaumauga a le NMR o loʻo faʻaalia ai o le C-terminus o le αS o loʻo pagatia i le tele o le gau o le fetuutuunai faʻafetaui aʻo taofia lona natura faʻaletonu, e pei o le isi vaega o le porotini, ona o ana fegalegaleaiga ma polycations.
Talu ai ona o le faʻalauteleina o le faailo CW-EPR o loʻo vaʻaia i le TEMPOL-122-αS condensed vaega e atagia mai ai le fegalegaleaiga o le porotini ma polycations, matou te faia se titration EPR e iloilo ai le fusifusia o le αS i polycations eseese i le leai o le LLPS (leai se faʻaputuina o Buffer LLPS), o loʻo fautua mai ai o fesoʻotaʻiga e tutusa i vaega faʻafefe ma faʻapipiʻi (lea e faʻamaonia e a tatou faʻamaumauga, Faʻaopoopoga Ata 4a ma Faʻaopoopoga Ata 6).O le fa'amoemoe o le va'ai pe fa'atasi uma, e ui lava i o latou uiga masani e pei o le sua, fa'aalia so'o se uiga fa'aeseesega fa'avae i le tulaga mole.E pei ona faʻamoemoeina, ua faʻalauteleina le alaleo o le EPR ma le faʻateleina o le polycation concentration, e atagia mai ai le faʻaitiitia o le fetuutuunai mole mole ona o fegalegaleaiga mole o paaga uma fegalegaleaiga toetoe lava o le saturation (Fig. 3e, Faʻaopoopo Fig. 6).Na ausia e le pLK lenei saturation i se fua molar maualalo (polycation:αS) faʻatusatusa i le ΔNt-Tau ma Tau441.O le mea moni, o le faʻatusatusaina o faʻamatalaga ma se faʻataʻitaʻiga faʻatusatusaga faʻatatau i nofoaga tutusa ma tutoʻatasi o loʻo faʻaalia ai o le faʻamavaega tumau o le pLK (~ 5 μM) o se faʻatonuga o le maualuga e maualalo ifo nai lo le Tau441 poʻo ΔNt-Tau (~ 50 μM ).µM).E ui lava o se faʻatusatusaga faigata lea, e taʻu mai ai o le αS e sili atu le vavalalata mo polycations faigofie ma faʻaauau pea le totogi lelei.Ona o lenei eseesega i le vavalalata i le va o le αS ma polycations eseese, matou te manatu e mafai ona suia a latou meatotino i le aluga o taimi ma mafatia ai i faiga LSPT eseese.
Ona o le tele o le siʻosiʻomaga i totonu o le protein coacervate ma le natura amyloid o le polotini, matou te matauina le amio a le coacervate i le taimi e iloa ai faiga LSPT talafeagai.I le faʻaaogaina o le BF ma le CF microscopy (Ata 4), na matou matauina ai o le αS / Tau441 e faʻapipiʻiina i se tulaga tele i le vaifofo, e fausia ai ni matāua tetele e faʻafesoʻotaʻi ma susu ai le pito i lalo o le vaieli / faʻasolo e pei o ni matāua atoa, e pei ona faʻamoemoeina (Fig Faaopoopo). .7d);matou te taʻua nei fausaga pito i lalo o "rafts protein".O nei fausaga na tumau pea le suavai aʻo latou taofiofia le malosi e fusia ai (Faʻaopoopo Ata 7b) ma e mafai ona vaʻaia mo ni nai itula talu ona faʻaosoina le LLPS (Fig. 4 ma le Faʻaopoopo Fig. 7c).Sa matou matauina o le faiga susu e fiafia i luga o le hydrophilic nai lo mea hydrophobic (Faaopoopo Ata. 7a), e pei ona faamoemoeina mo electrostatic coacervates ma tau le paleni ma o lea maualuga electrostatic luga gafatia.O le mea moni, o le αS/ΔNt-Tau coalescence ma le rafting na matua fa'aitiitia, ae o le αS/pLK condensates na matua fa'aitiitia (Fig. 4).I le taimi puupuu o le incubation, o le αS / pLK droplets na mafai ona faʻapipiʻi ma susu le hydrophilic surface, ae na vave ona taofi lenei gaioiga ma ina ua maeʻa le 5 itula o faʻamaʻi, naʻo mea faʻatapulaʻa faʻatasi ma leai se susu na matauina.- su'ega gel-trip.
Sui BF (fa'ailoga lanu efuefu) ma le CF (pane taumatau, AF488-fa'ailoga αS i lanu meamata) o fa'ata'ita'iga coacervate o lo'o iai le 100 µM αS (1% fa'ailoga fa'amalama) i le LLPS pa'u a'o iai le 100 µM Tau441 (pito i luga) ata fa'alelei) microscopic. -Tau (ogatotonu) poʻo le 1 mM pLK (pito i lalo) i taimi eseese faʻafefe ma maualuga maualuga (z, mamao mai le pito i lalo ole ipu lelei).O faʻataʻitaʻiga na toe faia 4-6 taimi tutoʻatasi o le tasi ma le isi ma faʻaiʻuga tutusa.αS/Tau441 coacervates e susu pe a uma le 24 itula, e fai ai va'a lapopoa nai lo le ata.Ole fua fua mo ata uma e 20 µm.
Ona matou fesili lea pe o le vaitaele tele-pei o le polotini na fausia i le αS/Tau441 LLPS o le a taʻitaʻia ai le amyloid aggregation o soʻo se polotini suʻesuʻeina.Na matou mulimulitaia le matua o le αS / Tau441 droplets i le taimi ma le WF microscopy i lalo o tulaga tutusa e pei ona i luga, ae faʻaaoga le 1 μM AF488-label αS ma Atto647N-labeled Tau441 (Fig. 5a).E pei ona faʻamoemoeina, na matou matauina le faʻaogaina atoa o le protein i le faagasologa o le matua.O le mea e malie ai, mai ca.Ina ua maeʻa le 5 itula, na matauina ai ni fausaga tetele e le o ni liʻo i totonu o vaʻa, lea na matou taʻua o "points", o nisi o ia mea na faʻapipiʻiina i le αS, ma o nisi na faʻatamaoaigaina i le Tau441 (Fig. 5a, aū paʻepaʻe).O nofoaga nei e masani ona matauina i totonu o va'a i se tulaga sili atu mo le αS/ΔNt-Tau nai lo le αS/ΔNt-Tau.E leai ni vaega ma'oti i matāua o le pLK ma le Tau e le'i mafai ona fa'afefiloi/susū.Ina ia suʻesuʻe pe o nei stains o loʻo i ai le αS ma le Tau441 o amyloid-pei aggregates, sa matou faia se faʻataʻitaʻiga tutusa e faʻaaoga ai le CF microscopy lea na faʻaigoaina ai Tau441 i le Atto647N ma le 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) na faʻaopoopoina mai le amataga.vali.E ui lava e leʻi matauina le ThT-staining o αS/Tau441 droplets poʻo vaʻa e tusa lava pe 24 h o faʻamaʻi (Fig. 5b, laina pito i luga-o totoe pa'ū i luga o polotini rafts), ThT-lelei fausaga o loʻo i ai Atto647N-Tau441 i totonu o vaʻa sa matua vaivai lava.e toe fa'atusa ai le lapo'a, foliga, ma le nofoaga o lo'o fa'amatalaina muamua (Ata 5b, laina ogatotonu ma lalo), e fa'ailoa mai ai e ono fetaui ma fa'aputuga amyloid-pei o lo'o fa'atupuina i le fa'aputuina o le sua tuai.
WF 25 μM αS i taimi eseese faʻafefete ma maualuga maualuga (z, mamao mai le pito i lalo) i le i ai o le 25 μM Tau441 (1 μM AF488-label αS ma le Atto647N-igoa Tau441) i totonu o se vaieli o le microscope plate ma le LLPS buffer) .E ono fa'ata'ita'iga na faia tuto'atasi ma fa'ai'uga tutusa.b CF microscopic ata o le 25 μM αS i luma o le 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-igoa Tau441) ma le 12.5 μM thioflavin-T (ThT).O matāua polotini mamafa ma fa'aputu polotini o lo'o fa'aalia i laina pito i luga ma ogatotonu.O le laina pito i lalo o loʻo faʻaalia ata o vaʻa ma paʻu mai 3 kopi tutoʻatasi.O aū pa'epa'e o lo'o fa'ailoa mai ai togi-ThT lelei i laulau uma e lua.Ole fua fua mo ata uma e 20 µm.
Ina ia suʻesuʻeina atili faʻamatalaga suiga i le coacervate protein network i le taimi o le suiga mai le vai i le malo, matou te faʻaogaina le faʻataʻitaʻiga o le olaga atoa (FLIM) ma le Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Ata 6 ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo 8 ma 9).Na matou manatu o le faʻatupuina o le faʻamaʻi o le laulau i totonu o se fausaga faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻapipiʻi pe oʻo lava i le malo e taʻitaʻia ai le vavalalata vavalalata i le va o le polotini ma le suʻega faʻafefe o loʻo faʻapipiʻi i ai, e mafai ona maua ai se aafiaga tineia faʻaalia i se faʻapuupuuina o le suʻega o le olaga (τ) , e pei ona faamatalaina muamua40.,41 ,42.E le gata i lea, mo faʻataʻitaʻiga faʻailoga faʻalua (AF488 ma Atto647N e pei o le FRET foaʻi ma le taliaina o vali), o lenei faʻaititia o le τ e mafai foʻi ona faʻatasi ma le coacervate condensation ma le faʻateleina o le FRET(E) lelei ile LSPT.Sa matou mata'ituina le fa'atupuina o va'a ma va'aiga i le aluga o taimi ile LLPS αS/Tau441 ma le αS/ΔNt-Tau fa'ata'ita'iga (25 µM o porotini ta'itasi ile LLPS buffer o lo'o iai le 1 µM AF488 fa'ailoga αS ma/po'o Atto647N fa'ailoga Tau441 po'o ΔNt-Tau).Na matou matauina se tulaga lautele i le umi o le fluorescence o le AF488 (τ488) ma le Atto647N (τ647N) na faʻaitiitia teisi aʻo faʻatupuina le coacervates (Fig. 6 ma le Faʻaopoopoga Ata 8c).O le mea e malie ai, o lenei suiga na matua faʻaleleia mo togitogi i totonu o vaʻa (Fig. 6c), e faʻaalia ai o le faʻateleina o le porotini na tupu i togitogi.I le lagolagoina o lenei mea, e leai se suiga taua i le ola o le fluorescence na matauina mo αS / ΔNt-Tau droplets ua matutua mo le 24 h (Faʻaopoopo Ata 8d), faʻapea o le faʻaogaina o le matāua o se gaioiga e ese mai le vaʻaia ma e le o faʻatasi ma le tele o le toe faʻatulagaina o mole. i totonu coacervates.E tatau ona maitauina o togitogi e eseese le lapopoa ma le fesuiaiga o mea i totonu o le αS, aemaise lava mo le αS / Tau441 system (Faʻaopoopo Ata 8e).O le faʻaitiitia o le ola o le fluorescence o loʻo faʻatasi ma le faʻateleina o le malosi, aemaise lava mo le Atto647N faʻaigoaina Tau441 (Faʻaopoopo Ata 8a), ma le maualuga maualuga o le FRET mo le αS / Tau441 ma le αS / ΔNt-Tau faiga, e faʻaalia atili ai le faʻamalosi i le LLPS Lima itula ina ua uma ona fa'aosoina, o polotini i totonu o le eletise tu'u ua fa'aputu.Pe a faatusatusa i le αS/ΔNt-Tau, na matou matauina le maualalo o le τ647N ma le maualuga o le τ488 tau i le αS/Tau441, faʻatasi ma le maualalo ma sili atu le tutusa o le FRET.Masalo, e mafai ona fesoʻotaʻi lenei mea i le mea moni e faapea i le αS / Tau441 system, o le matauina ma le faʻamoemoeina o le αS o loʻo i aggregates e sili atu ona eseese, e masani ona faʻatusatusa i le Tau, talu ai o Tau441 lava ia e mafai foi ona oʻo i le LLPS ma le faʻaopoopoga (Faʻaopoopo Ata 8e) .Ae ui i lea, o le maualuga o le matāua faʻatasi, faʻavaeina o vaʻa, ma, o le mea taua, o le faʻamaopoopoina o porotini i totonu o le vai-pei o le coacervates e maualuga pe a iai uma Tau441 ma le αS.
o ata o le αS/Tau441 ma le αS/ΔNt-Tau i le 25 μM o porotini taʻitasi (1 μM AF488-labeled αS ma le 1 μM Atto647N-labeled Tau441 poʻo ΔNt-Tau) ile LLPS buffer.O koluma o loʻo faʻaalia ata faʻatusa o faʻataʻitaʻiga LLPS i taimi eseese matua (30 min, 5 h ma 24 h).O le fa'avaa mumu o lo'o fa'aalia ai le itulagi o lo'o iai fa'ailoga αS/Tau441.O le umi o le olaga o loʻo faʻaalia e pei o pa lanu.Fua fua = 20 µm mo ata uma.e Fa'alia i totonu FLIM ata o le vaega ua filifilia, o lo'o fa'aalia i le pusa mumu i le laulau a.O lo'o fa'aalia le fa'aogaina o le fua lanu tutusa e pei o le laulau a.Fua fua = 5 µm.c Histograms o loʻo faʻaalia ai le AF488 (faʻapipiʻi i le αS) poʻo le Atto647N (faʻapipiʻi i le Tau) mo ituaiga polotini eseese (droplets-D-, raft-R- ma speckle-P) faʻaalia i ata FLIM faʻamaumau mo le αS-) faʻasologa o taimi i le olaga atoa o Tau441 ma αS / ΔNt-Tau faʻataʻitaʻiga faʻatasi (N = 17-32 ROI mo D, 29-44 ROI mo R, ma 21-51 ROI mo togi).O tau fa'atatau ma le vaeluagalemu o lo'o fa'aalia o sikuea samasama ma laina uliuli i totonu o atigipusa.O le pito i lalo ma le pito i luga o le pusa o loʻo faʻatusalia ai le quartile muamua ma le tolu, i le faasologa, ma o tau maualalo ma le maualuga i totonu o le 1.5-fold interquartile range (IQR) o loʻo faʻaalia e pei o le vavao.O fafo o loʻo faʻaalia o ni taimane uliuli.O le taua o fuainumera i le va o paga o tufatufaga na fuafuaina e faʻaaoga ai se lua-faʻataʻitaʻiga t-suʻega, faʻapea o eseesega le tutusa.E lua-tailed t-test p-value o loʻo faʻaalia i fetu mo paʻu taʻitasi o faʻamatalaga faʻatusatusa (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Fa'ailoa le fa'atauva'a (p-value > 0.05).O tau tonu p o loʻo tuʻuina atu i le Laulau Faʻaopoopo 1, ma o faʻamaumauga muamua o loʻo tuʻuina atu o faila faʻamaumauga mataʻutia.
Ina ia faʻaalia atili le natura o le amyloid o speckles / aggregates, matou te togafitia faʻataʻitaʻiga coacervate e leʻi pisia mo le 24 itula ma le maualuga maualuga o le (1 M) NaCl, lea na mafua ai le vavaeeseina o aggregates mai protein coacervates.Ina ua vaʻaia faʻasalalauga tuʻufaʻatasia (faʻataʻitaʻiga, o se vaifofo faʻasalalau o aggregates) e faʻaaoga ai le atomic force microscopy (AFM), na matou matauina le tele o le morphology spherical ma le maualuga masani e tusa ma le 15 nm, lea e foliga mai e fesoʻotaʻi i lalo o tulaga o le maualuga o le masima, tutusa ma le amio o fibrils amyloid masani ona o le malosi hydrophobic aafiaga i luga (matau o fibrils e masani ona i ai le maualuga o le ~ 10 nm) (Faaopoopo Ata 10a).O le mea e malie ai, ina ua faʻapipiʻiina faʻatasi faʻatasi ma ThT i se faʻataʻitaʻiga masani o le ThT fluorescence, na matou matauina le faʻatupulaia tele o le ThT fluorescence quantum yield, e faʻatusatusa i le mea na matauina pe a faʻapipiʻiina le vali i αS amyloid fibrils masani (Faʻaopoopo Ata 10b), faʻapea o lena mea. o aggregates coacervate o loʻo i ai fausaga e pei o le amyloid..O le mea moni, o faʻapotopotoga na faʻapalepale i le maualuga o le masima ae maaleale i le 4 M guanidine chloride (GdnHCl), pei o fibrils amyloid masani (Faʻaopoopo Ata 10c).
Na sosoo ai, na matou suʻesuʻeina le tuʻufaʻatasia o faʻapotopotoga e faʻaaoga ai le moli mole mole e tasi, faʻasalalauga faʻapitoa / faʻasalalauga faʻasolosolo (FCS / FCCS), ma suʻesuʻega paʻu o le lua-lanu coincidence detection (TCCD).I lea tulaga, matou te vavaeeseina faʻatasiga na faia ina ua maeʻa le 24 itula o faʻamaʻi i 100 μl LLPS faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le αS ma le Tau441 (uma 25 μM) faʻatasi ai ma le 1 μM AF488-faʻailoga αS ma le 1 μM Atto647N-faʻailoga Tau441.Fa'asusu le vaifofo fa'asalalau fa'atasi ua maua i se tulaga monomolecular e fa'aaoga ai le pa'u e tasi e leai se PEG ma le 1 M NaCl (le pa'u lava e tasi na fa'aaoga e tu'u'ese'ese ai aggregate mai le coacervate) e taofia ai so'o se feso'ota'iga fa'aeletise i le va o le LLPS ma le porotini.O se fa'ata'ita'iga o le fa'asologa o le taimi o se mole e tasi e mafai ona va'aia i le Ata 7a.O su'esu'ega a le FCCS/FCS (fa'asoa fa'asaga, CC ma le autocorrelation, AC) na fa'aalia ai o fa'aputuga o lo'o iai le αS ma le tau sa tele i fa'ata'ita'iga (va'ai le CC curve i le Ata 7b, vaega agavale), ma o le sili atu o le polotini monomeric na tula'i mai o se fa'ai'uga o le fa'agasologa o le fa'avaivai (silasila i pupuni AC i le Ata 7b, laulau agavale).Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga fa'atino i lalo o tulaga fa'afofo e tasi e fa'aaoga ai fa'ata'ita'iga o lo'o i ai na'o polotini monomeric na fa'aalia ai le leai o ni pupuni CC, ma o le fa'aogaina o le AC e fetaui lelei ma le fa'ata'ita'iga fa'asalalau fa'atasi (Eq. 4), lea o polotini monomeric o lo'o i ai le fa'amoemoeina fa'asalalau fa'atasi (Fig. 7b). ), laulau taumatau).O le fa'asalalauga fa'atasi o vaega fa'aputu'e e itiiti ifo i le 1 µm2/s, ma o polotini monomeric e tusa ma le 1 µm2/s.50–100 µm/s;o tau e tutusa ma tulaga fa'asalalau muamua mo sonicated αS amyloid fibrils ma monomeric αS eseese i lalo o tulaga tali tutusa44.Ina ua matou suʻesuʻeina faʻasalalauga faʻatasi ma TCCD suʻesuʻega paʻu (Fig. 7c, pito i luga), na matou iloa ai i totonu o faʻasalalauga taʻitasi taʻitasi (αS / Tau heteroaggregate), e tusa ma le 60% o faʻamaumauga na maua e aofia uma ai le αS ma le tau, e tusa ma le 30% o loʻo i ai naʻo. tau, e tusa ma le 10% αS na'o.O suʻesuʻega Stoichiometric o αS / Tau heteroaggregates na faʻaalia ai o le tele o heteroaggregates na faʻatamaoaigaina i le tau (stoichiometry i lalo ole 0.5, o le averesi o numera o tau mole mole faʻatasi e 4 taimi sili atu nai lo αS mole), lea e ogatasi ma la tatou galuega o loʻo matauina ile FLIM in situ. fa'ata'ita'iga..O suʻesuʻega a le FRET na faʻaalia ai o nei faʻapotopotoga o loʻo i ai uma polotini, e ui lava e le taua tele le taua o le FRET i lenei tulaga, talu ai o le tufatufaina o fluorophores i faʻapotopotoga taʻitasi na faʻafuaseʻi ona o le sili atu o le porotini e le faʻamaonia na faʻaaogaina i le suʻega.O le mea e malie ai, ina ua matou faia le suʻesuʻega tutusa e faʻaaoga ai le 45,46 matua o le amyloid aggregation-deficient Tau variant (silasila i le Ata Faʻaopoopo 11a,b), na matou matauina e ui lava o le αS electrostatic aggregation e tutusa (Faʻaopoopo Fig. 11c, d), o le malosi e fausia ai aggregates i totonu o le coacervate na matua faʻaititia ma FLIM iloa ai le tele o vaega i totonu o faʻataʻitaʻiga, ma vaʻavaʻai faʻasolosolo faʻasolosolo na matauina mo faʻataʻitaʻiga tuʻufaʻatasia tuʻufua.Ae ui i lea, mo se numera itiiti o faʻasalalauga faʻapitoa (naʻo le tasi vaesefulu o le Tau441), na matou matauina o faʻapotopotoga taʻitasi na faʻatamaoaigaina i le αS nai lo lenei Tau, ma e tusa ma le 50% o faʻamaumauga na maua e naʻo le αS molelaʻau, ma le αS e eseese tele. .fa'aputuga (silasila Fa'aopoopo Ata 11e), e fa'afeagai ma fa'aputuga eseese na gaosia e Tau441 (Fig 6f).O fa'ai'uga o nei su'esu'ega na fa'aalia ai e ui lava e mafai e le αS lava ia ona fa'aputuina ma le tau i totonu o le coacervate, e sili atu le lelei o le fa'au'uga tau i lalo o nei tulaga, ma o fa'aputuga pei o le amyloid e mafai ona galue o se ituaiga o le αS ma le tau.Peita'i, o le taimi lava e fa'atupu ai se fa'atamaoaiga tau-tau, e fa'amanuiaina feso'ota'iga heterotypic i le va o le αS ma le tau i fa'atasiga nai lo feso'ota'iga homotypic i le va o mole mole tau;matou te va'aia fo'i feso'ota'iga polotini i le vai αS/tau coacervates.
a Sui fluorescence tulaga faaletino o mole mole tasi o aggregates tuufua faia i αS/Tau441 electrostatic coacervates.O paʻu e fetaui ma αS / Tau441 coaggregates (paʻu i luga aʻe o le faʻailoga ua faʻaalia) na matauina i auala e tolu e iloa ai (AF488 ma Atto647N faʻamalo pe a uma le faʻamalosi saʻo, laina lanumoana ma mumu, Atto647N faʻamaʻi pe a maeʻa le faʻaogaina), FRET, laina violet).e FCS/FCCS su'esu'ega o se fa'ata'ita'iga o fa'aputuga tu'ufua αS/Tau441 maua mai le LLPS (tulaga agavale).O pupuni o le Autocorrelation (AC) mo le AF488 ma le Atto647N o lo'o fa'aalia i le lanumoana ma le mumu, fa'atasi, ma fa'asologa o feso'ota'iga (CC) e feso'ota'i ma fa'aputuga o lo'o i ai vali e lua o lo'o fa'aalia i le lanu viole.O pupuni AC o lo'o atagia mai ai le fa'ailogaina o le monomeric ma fa'aputuga ituaiga polotini, a'o fa'ailoga CC o lo'o fa'aalia ai na'o le fa'asalalauina o fa'aputuga fa'ailoga fa'alua.Ole su'esu'ega tutusa, ae i lalo ole tulaga fa'afofoga tutusa e pei o nofoaga tu'ufua, o fa'ata'ita'iga o lo'o iai na'o monomeric αS ma Tau441 o lo'o fa'aalia e pei o fa'atonuga ile laulau taumatau.c Su'esu'ega moli felafolafoa'i o molela'au ta'itasi o fa'aputuga tu'ufua fa'atupu i αS/Tau441 coacervates eletise.O faʻamatalaga mo faʻasalalauga taʻitasi o loʻo maua i faʻasologa eseese e fa (N = 152) o loʻo faʻatatau i latou stoichiometry, S tau, ma le FRET lelei (pito i luga, lanu lanu e atagia ai mea na tupu).E tolu ituaiga o fa'aputuga e mafai ona fa'ailogaina: -αS-na'o fa'atasi ma le S~1 ma le FRET~0, Tau-na'o fa'atasi ma le S~0 ma le FRET~1, ma ese'ese Tau/αS fa'atasi ma le vaeluagalemu S ma le FRET Tala fa'atatau o le aofa'i. o polotini fa'ailoga e lua o lo'o maua i fa'apotopotoga eseese ta'itasi (N = 100) o lo'o fa'aalia i le laulau pito i lalo (o le fua lanu e atagia ai le mea na tupu).O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.
O le matua po o le matua o le polotini vai condensates i gel-pei po'o fausaga mausali i le aluga o taimi ua lipotia mai e aafia ai i le tele o galuega physiological o le condensate47 faapea foi ma faamai, o se faiga le masani ai muamua amyloid aggregation 7, 48, 49. matou te suʻesuʻeina le vaeluaga o vaega ma amioga i auiliiliga.LSPT αS i le i ai o polycations faʻafuaseʻi i totonu o se siosiomaga pulea i le maualalo micromolar concentrations ma tulaga physiologically talafeagai (ia maitauina o le fuafuaina o le physiological concentration o le αS e> 1 µM50), mulimuli i amioga masani thermodynamically faʻaosoina o LPS.Na matou iloa o le αS, o loʻo i ai se vaega C-terminal e sili ona leaga le molia i le pH physiological, e mafai ona fausia ni matāua mauoa i le polotini i le vai vai e ala i le LLPS i le i ai o peptides faʻaleagaina maualuga e pei o pLK poʻo Tau e ala i le faagasologa o le electrostatic. condensation lavelave i le i ai o macromolecules aggregation.O lenei faagasologa e ono iai ni a'afiaga talafeagai i totonu ole si'osi'omaga feavea'i o lo'o feagai ai le αS ma molela'au polycationic eseese e feso'ota'i ma lona fa'ama'i fa'atasi fa'atasi uma i vitro ma vivo51,52,53,54.
I le tele o suʻesuʻega, o le malosi o le polotini i totonu o matāua ua manatu o se tasi o mea taua e fuafua ai le faʻasologa o le matua55,56.I le electrostatic αS coacervates ma polycations, o le faagasologa o le matua e foliga mai e faalagolago i le malosi o fegalegaleaiga ma polycations, le valence, ma le tele o nei fegalegaleaiga.Fai mai a'oa'oga paleni e faapea o se laufanua paleni o setete vai e lua o le i ai lea o se matau'a tele e mauoa i biopolymers e ave ai le LLPS57,58.E mafai ona ausia le tuputupu aʻe o le matāua e ala i le Ostwald maturation59, coalescence60 poʻo le faʻaaogaina o le monomer saoloto i le vaega taape61.Mo le αS ma le Tau441, ΔNt-Tau poʻo le pLK, o le tele o le porotini na faʻapipiʻi i le condensate i lalo o tulaga na faʻaaogaina i lenei suʻesuʻega.Peita'i, a'o fa'aputu fa'atasi matā'a tau lapo'a i luga o le susū, o le matāua fa'atasi ma le susū sa faigata mo le ΔNt-Tau ma le pLK, ma fa'ailoa mai ai le vave mou atu o mea vai i nei faiga e lua.E tusa ai ma la matou suʻesuʻega FLIM-FRET, o le pLK matutua ma le ΔNt-Tau droplets na faʻaalia ai se tikeri tutusa o le faʻapipiʻiina o le polotini (faʻataʻitaʻiga i le olaga atoa) e pei o uluaʻi matāua, o loʻo taʻu mai ai o le uluai fesoʻotaʻiga polotini na taofia, e ui ina sili atu le malosi.
Matou te fa'amanino a matou taunu'uga fa'ata'ita'iga i le fa'ata'ita'iga lea (Ata 8).O matāua muamua na fausia mo sina taimi e masani lava o fesoʻotaʻiga polotini e aunoa ma se taui eletise, ma o loʻo i ai ni vaega o le le paleni o le totogi, aemaise lava i le faʻaogaina o le matāua, e mafua ai le matāua ma se maualuga eletise eletise.Ina ia totogi le totogi (o se mea e masani ona taʻua o le valence depletion) ma faʻaitiitia le malosi o le matāua, e mafai e le matāua ona aofia ai ni polypeptides fou mai le vaega faʻafefete, toe faʻatulagaina fesoʻotaʻiga polotini e faʻamalieina ai fefaʻatauaiga totogi, ma fegalegaleai ma isi matāua.i luga (susu).O le αS / pLK droplets, ona o la latou fesoʻotaʻiga polotini faigofie (naʻo fegalegaleaiga heterotypic i le va o le αS ma le pLK) ma sili atu le vavalalata mo fegalegaleaiga protein-protein, e foliga mai e mafai ona faapaleni vave le tau o le condensate;ioe, matou matauina kinetics porotini vave i le uluai fausia αS/pLK coacervates nai lo le αS/Tau.Pe a uma le valence depletion, o fegalegaleaiga e faaitiitia ephemeral ma le matāua leiloa a latou meatotino vai ma liliu i gel-pei, matāua le mu-mu ma e maualalo le eletise eletise (ma o lea e le mafai ona susu le luga).I se fa'afeagai, e itiiti le lelei o matāua αS/Tau i le fa'atumauina o le paleni o le tau o le matāua ona o feso'ota'iga polotini lavelave (fa'atasi ai ma fefa'ataua'iga homotypic ma heterotypic) ma le natura vaivai o feso'ota'iga polotini.E i'u ai i matāua e taofia ai le vai mo se taimi umi ma fa'aalia ai le maualuga o le fa'aeletise i luga o le eleele e foliga mai e fa'aitiitia e ala i le fa'afefiloi ma le fa'atupula'ia (fa'aitiitiina ai le maualuga/volume ratio o matāua) ma le susūina o le kemi o le hydrophilic.Ole mea lea e fa'atupuina ai le tele o faletusi porotini e fa'atumauina ai le suavai a'o fa'aauau pea le fegalegaleai ona o le su'esu'eina faifaipea mo le fa'asiliina o tau ile feso'ota'iga polotini.O le mea e mata'ina ai, o le N-terminally trunned forms of Tau, e aofia ai nisi o isoforms62, o lo'o fa'aalia le amio fa'avaitaimi, fa'atasi ai ma nisi o lo'o fa'aopoopoina le matua ma le αS i ni matā'ua pei o le gel e umi le ola, a'o isi e liua i ni fa'aputu vai tetele.O lenei tulaga lua i le matua o le αS electrostatic coacervates e ogatasi ma suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga ma suʻesuʻega faʻataʻitaʻi a le LLPS talu ai nei ua faʻamaonia ai se faʻamaopoopo i le va o le valence depletion ma le electrostatic sieving i condensates e fai ma ki i le puleaina o le tele o le condensate ma le suavai.Fa'ainisinia 58.61.
O lenei polokalame o loʻo faʻaalia ai le auala faʻapipiʻi amyloid mo le αS ma le Tau441 e ala i le LLPS ma le LSPT.Fa'atasi ai ma vaega fa'aopoopo e maua ai le anion (mumu) ma le cation-rich (lanumoana), αS ma tau electrostatic coacervates ma valence fa'amalieina e maualalo le malosi i luga o le fogaeleele ma o le mea lea e fa'aitiitia ai le fa'afefiloi, e mafua ai le matua o le matāua vave.Ua maua se tulaga mautu e le'i agglomerated gel..O lenei tulaga e sili ona lelei i le tulaga o le αS / pLK system ona o lona maualuga maualuga ma sili atu le faigofie o le protein-pair interaction network, lea e mafai ai ona vave suiga o le gel.I se isi itu, o matāua e le lelei le valence ma, o le mea lea, o loʻo avanoa vaega e tumu i polotini mo fegalegaleaiga, e faigofie ai mo le coacervate ona faʻafefiloi ma susu le hydrophilic surface ina ia faʻaitiitia ai lona malosi maualuga.O lenei tulaga e sili atu mo αS/Tau441 coacervates, o loʻo i ai se fesoʻotaʻiga lavelave tele e aofia ai fesoʻotaʻiga vaivai Tau-Tau ma αS-Tau.I le isi itu, o le coacervates lapopoa o le a sili atu ona faigofie ona taofi a latou mea e pei o le sua, e mafai ai ona tupu isi fegalegaleaiga protein-i-protein.Mulimuli ane, o amyloid heterogeneous aggregates o loʻo iai uma le αS ma le tau i totonu o le sua faʻafefe, lea e mafai ona fesoʻotaʻi ma mea o loʻo maua i totonu o tino, o faʻailoga ia o faʻamaʻi neurodegenerative.
O fausaga tetele e pei o le sua na fausia i le taimi o le matua o le αS/Tau441 ma se si'osi'omaga polotini malosi tele ma, i se tulaga la'ititi, αS/ΔNt-Tau coacervates o faatanoa lelei mo le fa'atosinaina o le fa'aputuga o porotini.Ua matou matauina moni lava le fa'atupuina o fa'aputuga polotini mautu i lea ituaiga porotini coacervates, e masani ona iai uma le αS ma le tau.Ua matou faʻaalia o nei heteroaggregates o loʻo faʻamautu e ala i fesoʻotaʻiga e le-electrostatic, e mafai ona fusifusia le amyloid-specific ThT dyes i le auala tutusa e pei o fibrils amyloid masani, ma e moni lava e tutusa le tetee i aafiaga eseese.O fa'aputuga αS/tau na fausia e le LLPS na fa'aalia e iai ni mea e pei o le amyloid.O le mea moni, o le suiga matua o Tau e le atoatoa i le amyloid aggregation e matua faʻaleagaina i le faʻavaeina o nei αS aggregates eseese i totonu o le coacervate eletise eletise.O le faʻavaeina o αS / Tau441 aggregates na matauina naʻo totonu o le coacervates, lea na taofia ai mea e pei o le vai, ma e leai lava, pe afai e le oʻo atu le coacervates / droplets i le tulaga gel.I le tulaga mulimuli, o le faʻateleina o le malosi o fesoʻotaʻiga eletise ma, o se taunuuga, o le faʻamalosi o le fesoʻotaʻiga polotini e taofia ai le toe faʻaleleia o le protein e faʻavaeina ai fesoʻotaʻiga fou e manaʻomia mo le amyloid nucleation.Ae ui i lea, e mafai ona ausia lenei mea i le sili atu ona fetuutuunai, pei o le vai-pei o le coacervates, lea e sili atu ona tumau pea le suavai pe a faateleina le lapopoa.
O le mea moni o le faʻavaeina o mea faʻapipiʻi i totonu o le vaega condensed e sili atu i le αS / Tau condensates lapopoa nai lo tamaʻi mataua e vave gel, faʻamaonia le taua o le faʻamaonia o mea e pulea ai le faʻafefiloi o matāua.O le mea lea, e le gata o loʻo i ai se uiga mo le vavaeeseina o vaega, ae o le tele o le condensate e tatau ona pulea mo le faʻaogaina lelei faʻapea foʻi ma le puipuia o faʻamaʻi58,61.O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai le taua o le paleni i le va o le LLPS ma le LSPT mo le αS/Tau system.E ui o le fa'atupuina o le matāua e mafai ona puipuia mai le fa'aputuga o le amyloid e ala i le fa'aitiitia o le aofa'i o polotini monomers o lo'o maua i lalo o tulaga saturation, e pei ona fa'ata'ita'i mai i isi faiga63,64, o le fusuaga o le matāua i le maualuga o le matāua e mafai ona o'o atu ai i le fa'aputuina o porotini i totonu e ala i le fa'agesegese o le fa'atulagaina o suiga.feso'ota'iga polotini..
I le aotelega, o matou faʻamaumauga e faʻamalosia malosi ai le taua o le valence felagolagomaʻi ma fegalegaleaiga faʻamalieina / le faʻamalieina i fesoʻotaʻiga pa'ū i totonu o le LSPT.Aemaise lava, matou te faʻaalia o condensates αS / Tau441 atoa-umi e mafai ona faʻaogaina lelei ma faʻapipiʻi e fausia ai le amyloid-pei o le heteroaggregates e aofia uma ai polotini ma faʻatulagaina se masini mole e faʻavae i luga oa matou faʻataʻitaʻiga.O le tuufaatasia o polotini e lua i le αS / Tau fluid coacervate lea matou te lipotia iinei atonu e moni lava e fesootai ma le co-localization o lua polotini i inclusions, ia o faailoga o le faamai, ma e mafai ona fesoasoani i le malamalama i le sootaga i le va o le LLPS ma amyloid aggregation, saunia le auala mo le maualuga o le IDP i le neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, cysteine mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ma ΔCt-αS variants (Δ101-140) na faʻaalia i le E. coli ma faʻamamaina e pei ona faʻamatalaina muamua.5 mM DTT na aofia i laʻasaga uma i le faʻamamaina o le αS cysteine mutants e puipuia ai le faʻavaeina o faʻamaufaʻailoga disulfide.Tau441 isoform (plasmid maua mai Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1-150, maua e cloning IVA ma primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ma AggDef-Tau variant sa EGC.3TC275 muamua aganuʻu (1ΔTC5-Tau faʻamamā) tupu aʻe i le OD600 = 0.6-0.7 i le 37 ° C ma le 180 rpm, ma faʻaalia le faʻaaliga i le IPTG mo le 3 itula i le 37 ° C.Seleseleni sela i le 11,500 xg mo le 15 min i le 4 °C ma fufulu i le saline buffer o loʻo i ai le 150 mM NaCl.Toe tu'u le pellet i le lysis buffer (20 ml i le 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).O le sonication laasaga na faia i luga o le aisa ma se amplitude o 80% mo 10 pulses (1 min i luga, 1 min off).Aua le sili atu i le 60 ml i le tasi ultrasound.E. coli lysates na faʻamafanafanaina i le 95 ° C. mo le 20 minute, ona faʻamafanafanaina lea i luga o le aisa ma faʻamalo i le 127,000 × g mo le 40 minute.O le supernatant faʻamalamalamaina na faʻaaogaina i le 3.5 kDa membrane (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) ma faʻafefeteina e faasaga i le 4 L o le faʻamama toto (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM. , PMSF 0.1 mM) mo le 10 itula.O le 5 ml cation exchange column (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ISA) na faʻapipiʻiina ma faʻapipiʻi paleni (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).O le tau lysate na faʻamamaina e ala i le 0.22 μm PVDF faamama ma tui i totonu o le koluma i le tafe o le 1 ml / min.Na fa'asolosolo malie le fa'afefeteina, na fa'afefeteina le tau i le 15-30% fa'afefete fa'afefe (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).O vaega ninii na su'esu'eina e le SDS-PAGE, ma so'o se vaega ninii o lo'o i ai se fusi e tasi ma le mamafa mole mole fa'amoemoeina o le tau na fa'atumauina e fa'aaoga ai le 10 kDa centrifuge faamama ma suia i se pa'u e iai le 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ma le DTT 2 mM mo o le fa'ai'uga o le porotini mulimuli o le 100 μM.O le vaifofo o le porotini na pasi atu i le 0.22 μm PVDF faamama, vave aisa ma teu i le -80°C.Protein K18 na saunia lelei e Prof. Alberto Boffi.O le mama o le sauniuniga na> 95% e pei ona faʻamaonia e le SDS-PAGE ma MALDI-TOF/TOF.O cysteinees eseese na fa'aigoaina fa'ama'i ile AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ISA) po'o le TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanata).na faʻamaonia e ala i le absorbance ma MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ma K18 na faʻailogaina i le cysteine residues i tulaga 191 ma le 322 faʻaaoga Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Siamani) mulimuli i le faiga lava e tasi.Ole tau ole totogi ile fa'afanua totoe mo le αS ma le Tau441 na fa'aaogaina ile CIDER66.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 e tusa ai ma le NMR mai le faʻatau, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ISA) na faʻamavaeina i le 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 i le 10 mM faʻatonuga, faagasologa sonicated mo 5 minute ile vai taele ma teu ile -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ISA) ma FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, ISA) o vai soluble ma tufatufaina lautele i le LLPS buffer.Fa'amama toto e aveese ai masima leaga.Ona faʻamamāina lea e ala i se tui tui ma le tele o le pore o le 0.22 μm, ma o latou faʻatonuga na fuafuaina e faʻaaoga ai se refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, ISA).LLPS faʻataʻitaʻiga na saunia i le vevela o le potu i le faʻasologa o loʻo i lalo: faʻafefiloi ma faʻapipiʻiina ma 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) ma le faʻafefiloi o le 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Ona fa'aopoopoina lea o le αS ma polycations fused (filifiliga pLK po'o Tau).Mo fa'ata'ita'iga fa'asologa o taimi thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), fa'aaoga le aofa'i o le ThT e avea ma afa o le fa'atonuga αS.Fa'afefiloi lemu ae mae'ae'a fa'ata'ita'iga ina ia mautinoa e tutusa.O le fa'atonuga o vaega ta'itasi e fesuisuia'i mai le fa'ata'ita'iga i le fa'ata'ita'iga, e pei ona fa'amatalaina i le vaega I'uga.Azide na faʻaaogaina i le faʻatonuga o le 0.02% (w / v) i soʻo se taimi e sili atu ai le umi ole suʻega ile 4 itula.Mo su'esu'ega uma e fa'aaoga ai fa'ata'ita'iga LLPS, fa'ataga le paluga e fa'afetaui mo le 5 minute a'o le'i faia le su'esu'ega.Mo su'esu'ega fa'asalalauina mama, 150 µl o fa'ata'ita'iga na utaina i luga o microplate 96-well e le o fusifusia (μClear®, uliuli, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ma ufiufi i ata fa'apipi'i.LLPs na mataituina e ala i le fuaina o le absorbance i le 350 nm i le ogatotonu o le vaifofo i le CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Siamani).O faʻataʻitaʻiga na faia i faʻatolu i le 25 ° C, ma o mea sese na faʻatatauina o le faʻasologa masani mai le uiga.O le vaega faʻafefe na faʻatusatusaina e ala i faʻataʻitaʻiga centrifugation ma suʻesuʻega gel SDS-PAGE, ma o le vaega αS i vaega faʻafefete ma faʻapipiʻi sa faʻatusatusaina i fofo LLPS eseese.O se faʻataʻitaʻiga 100 μl LLPS o loʻo i ai le 1 μM AF488-labeled αS na saunia e ala i le faʻafefiloi maeʻaeʻa ona sosoo ai lea ma le centrifugation i le 9600 × g mo le 30 minute, mulimuli ane e masani ona iloa le paʻu.O le pito i luga 50 μl o le supernatant na faʻaaogaina mo le faʻatusatusaina o le porotini e faʻaaoga ai le gel SDS-PAGE.Na su'esu'e gels i le AF488 filiga e fa'aaoga ai le ChemiDoc gel imaging system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) po'o le pisia i le Coomassie stains ma va'ava'ai i filiga talafeagai.O vaega na maua mai na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, USA).O fa'ata'ita'iga sa faia fa'alua i fa'ata'ita'iga 'ese'ese se lua ma fa'ai'uga tutusa.
E masani lava, 150 μl o faʻataʻitaʻiga na faʻaaogaina i microplates e le faʻapipiʻiina 96-well ma vaʻavaʻai i le vevela o le potu i luga o le Leica DMI6000B inverted microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Siamani).Mo suʻesuʻega faʻapitoa, µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Siamani) poʻo 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) sa faʻaaogaina foi.EL6000 halogen poʻo le mercury metal halide lamepa sa faʻaaogaina e fai ma faʻamalamalamaga (mo BF / DIC ma WF ata, faʻasologa).Mo WF microscopy, o le 40x magnification air goal (Leica Microsystems, Siamani) na faʻaaogaina e taulaʻi le malamalama i luga o le faʻataʻitaʻiga ma aoina.Mo AF488 ma ThT fa'aigoaina fa'ata'ita'iga, fa'amama fa'afiafiaga ma fa'aulu fa'atasi ai ma seti fa'amama GFP, fa'afiafiaga ma fa'amama fa'aulu, fa'asologa, 460-500 nm ma 512-542 nm fa'amama fa'amama, ma se fa'ata 495 nm dichroic.Mo faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻailogaina i le Atto647N, o se seti masani o Cy5 filiga faʻatasi ma le faʻamalosi ma le faʻaaogaina o le bandpass filiga 628-40 nm ma le 692-40 nm, i le faasologa, ma le 660 nm dichroic faʻata na faʻaaogaina.Mo le BF ma le DIC microscopy, fa'aoga tutusa le fa'amoemoe o le aoina o moli.O le malamalama na aoina na pueina i luga o le Leica DFC7000 CCD kamera (Leica Microsystems, Siamani).O le taimi fa'aalia o le 50 ms mo le BF ma le DIC microscopy imaging ma le 20-100 ms mo le WF microscopy imaging.Mo faʻatusatusaga, o le taimi faʻaalia mo suʻega uma ma ThT o le 100 ms.Na faia su'esu'ega taimi-lase e va'ava'ai i le fa'atasi o le matāua, ma ata e aoina i le 100 ms mo ni nai minute.ImageJ (NIH, ISA) na faʻaaogaina mo le auiliiliga o ata.O fa'ata'ita'iga sa faia fa'atolu fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.
Mo su'esu'ega fa'akolo, FRAP ma le 3D toe fa'aleleia, na maua ata i luga o le Zeiss LSM 880 fa'aliliu'ese'ese microscope fa'aogaina le ZEN 2 lanu lanumoana (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Siamani).O faʻataʻitaʻiga o le 50 μl na faʻaaogaina i ipu µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Siamani), togafitia i se polymer hydrophilic (ibiTreat) ma faʻapipiʻi i se 63x suauʻu faʻatofuina sini (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) luga ole DIC).Na maua ata e faʻaaoga ai le 458 nm, 488 nm, ma le 633 nm argon laser laina faʻatasi ai ma se iugafono o le 0.26 µm / pika ma se taimi faʻaalia o le 8 µs / pika mo le faʻamalosi ma faʻamalama faʻamalama o le 470-600 nm, 493-628 nm, ma le 638-755 nm na faʻaaogaina e vaʻaia ai le ThT, AF488 ma le Atto647N.Mo fa'ata'ita'iga a le FRAP, sa fa'amauina ata fa'ataimi taimi o fa'ata'ita'iga ta'itasi ile 1 fa'avaa ile sekone.O fa'ata'ita'iga sa faia fa'atolu i le vevela o le potu fa'atasi ai ma fa'ai'uga tutusa.O ata uma na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Siamani).O pupuni o le FRAP na faʻavasegaina, faʻapipiʻi ma faʻapipiʻi i le malosi / taimi faʻamaumauga na maua mai ata e faʻaaoga ai le Zen 2 faʻaaoga OriginPro 9.1.O pupuni o le toe fa'aleleia na fa'apipi'iina i se fa'ata'ita'iga e tasi fa'atele e fa'atatau i le fa'asalalauina mole mole fa'atasi ai ma se fa'aupuga fa'aopoopo fa'aopoopo e fa'atatau i le a'afiaga o le fa'amama.Ona matou fuafuaina lea o le D i le faʻaaogaina o le radius bleaching nominal ma le toe faʻaleleia muamua o le afa-ola e pei o le tutusa a Kang et al.5 35 faaalia.
O fesuiaiga o le cysteine tasi o le αS na faʻapipiʻiina ma le 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) i tulaga 24 (TEMPOL-24-αS) ma le 122 (TEMPOL-122-αS), taitasi.Spin Labeling Mo suʻesuʻega a le EPR, o le faʻatonuga o le αS na faʻatulagaina i le 100 μM ma le faʻaogaina o le PEG o le 15% (w / v).Mo tulaga tu'ufa'atasiga eseese, o le αS:pLK ratio o le 1:10, ae o le αS:ΔNt-Tau ma le αS:Tau441 sa tumau pea ile 1:1.Mo suʻesuʻega titration fusifusia i le leai o se tumutumu, TEMPOL-122-αS sa tausia i le 50 μM ma polycations titrated i le faateleina concentrations, saunia tulaga taitasi eseese.Ole fua ole CW-EPR sa fa'atinoina ile fa'aogaina ole fa'aogaina ole fusi ole Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer fa'apipi'iina ma le Bruker ER4118 SPT-N1 resonator o lo'o fa'agaoioia ile microwave (SHF) taimi ole ~ 9.7 GHz.O le vevela na tuʻuina i le 25 ° C ma pulea e se cryostat nitrogen liquid.O le alaleo na maua i lalo o tulaga e le'i tumu i le malosi MW o le 4 mW, o le fa'aogaina o le amplitude o le 0.1 mT, ma le fa'aogaina o le 100 kHz.O le malosi o le spectral na fa'avasegaina ina ia aloese ai mai le eseesega i le va o fa'ata'ita'iga ma fa'aitiitiga fa'aitiitiga e ono mafai ona fa'atupuina ona o toega fa'aitiitiga o vaila'au fa'aitiitiga i fa'ata'ita'iga o lo'o i ai le Tau441 po'o le ΔNt-Tau (o lo'o iai i ulua'i vaifofo polotini).O tau na tu'uina atu o le g na maua ona o le fa'ata'ita'iga fa'apitoa a le EPR na fa'atinoina i le fa'aogaina o le Easyspin software (v. 6.0.0-dev.34) na fa'atinoina i Matlab®67.Tasi/lua vaega faʻataʻitaʻiga isotropic na faʻaaogaina e faʻataʻitaʻiina ai faʻamaumauga.A mae'a ona fa'avasega fa'ailoga uma, o mea na totoe na fa'atatauina e ala i le toesea o fa'ata'ita'iga ta'itasi mai le fusi fa'ata'ita'i tutusa.Mo le suʻesuʻeina o le fusifusia, o le malosi faʻatusatusa o le vaega lona tolu i le vaega lona lua o le alaleo EPR masani (IIII / III) na faʻaaogaina e mataʻituina ai le fusifusia o polycations i le αS.Ina ia fa'atusatusa le fa'asologa tumau (Kd), o le fa'ai'uga o le pi'o na fa'apipi'iina i se fa'ata'ita'iga fa'atatau i ni nofoaga fa'amau tuto'atasi.
O fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga a le NMR na fa'aaogaina e fa'aaoga ai le Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer fa'apipi'iina i se cryoprobe ma le Z-gradient.O faʻataʻitaʻiga uma na faia e faʻaaoga ai le 130-207 μM αS ma tutusa αS / ΔNt-Tau ma pLK tutusa ile 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ma sa faia ile 15°C.Ina ia mata'ituina le LPS e le NMR, 10% PEG na fa'aopoopoina i fa'ata'ita'iga muamua fa'afefiloi.O lo'o fa'aalia e le fa'asologa o suiga fa'akomepiuta (Fig. 1b) le averesi o suiga ole 1H ma le 15N.O le αS 2D1H-15N HSQC spectra na tofia e faʻavae i luga o se tofiga muamua (BMRB entry #25227) ma faʻamaonia e ala i le pueina ma le auiliiliga o le 3D spectra o HNCA, HNCO ma CBCAcoNH.13Cα ma le 13Cβ suiga kemikolo na fuafuaina i le i ai o le ΔNt-Tau poʻo le pLK e fuaina ai suiga talafeagai i tulaga lona lua fausaga faʻatusatusa i le αS chemical shifts i le mama random coil conformation 68 (Faaopoopo Ata 5c).O fua faatatau R1ρ na fuaina e ala i le pueina o suʻesuʻega hsqctretf3gpsi (maua mai le faletusi a Bruker) faʻatasi ai ma le tuai o le 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ma le 800 ms, ma o galuega faʻapitoa na fetuutuunai i le maualuga o le faʻatuai. taimi e fuafua ai le R1ρ ma lona fa'ata'ita'iga le mautinoa.
E lua-lanu suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga faʻasalalau MT200 faʻatau (PicoQuant, Perelini, Siamani) faʻatasi ai ma se masini numera tasi photon (TCSPC).O le laser diode ulu o loʻo faʻaaogaina mo le pulsed interleaved excitation (PIE), o le ave e ui atu i se taʻiala faʻafefe e tasi ma faʻalogo i le mana leisa o le 10 i le 100 nW mo 481 nm ma 637 nm laina leisa fuaina pe a uma se faʻata dichroic.Ole mea lea e fa'amautinoa ai se fua fa'atatau o le faitau aofa'i o le photon, 'alo'ese mai a'afiaga ole fa'aigoa o le photon, fa'amamafa ma le saturation.μ-Slide angiogenesis coverslips po o papatusi (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Siamani) sa tuu saʻo i le vai faatofu i luga o se tioata Super Apochromat 60x NA 1.2 ma se kola faasaʻo (Olympus Life Sciences, Waltham, ISA).O le 488/640 nm dichroic fa'ata (Semrock, Lake Forest, IL, ISA) na fa'aaogaina e fai ma fa'aulu autu.Ua poloka le fa'avevela e le'i fa'asalaina e se pu e 50 microns le lautele, ona vaevaeina lea o le fa'avevela fa'atatau i le 2 auala e iloa ai e le 50/50 beam splitter.Bandpass emission filters (Semrock, Lake Forest, IL, ISA) 520/35 mo le lanu meamata (AF488) ma le 690/70 mo le lanu mumu (Atto647N) na faʻaaogaina i luma o le mea e iloa ai.Diodes avalanche tasi-photon (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) na faʻaaogaina e fai ma faʻamatalaga.Na fa'atinoina uma fa'amaumauga ma au'ili'iliga i le fa'aogaina o le polokalame fa'apisinisi SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Perelini, Siamani).
E limasefulu microliters o faʻataʻitaʻiga LLPS na faʻaaogaina i vaieli μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Siamani).O ata e maua mai e taula'i i le 20 µm i luga a'e o le vaieli pito i lalo mo le mamao lelei o galuega fa'amoemoe mo matāua taofi ma i le ~ 1 µm mo va'a ma togitogi fa'atasi ai ma le fa'ai'uga axial e le itiiti ifo i le 0.25 µm/pixel ma le taimi tuai o le 400 µs/pixel.Filifili fa'amaumauga e ala i le fa'aogaina o se fa'ailoga malosi e fa'atatau i le averesi o fa'ailoga fa'ailoga (PBG, o lona uiga + 2σ) mo alalaupapa ta'itasi ina ia na'o pa'u polotini vai, va'a, po'o fa'ailoga e filifilia, e fa'amama ai so'o se mea e tupu mai i le vaega taape.Ina ia au'ili'ili le umi o le ola o ituaiga ta'itasi (τ) o ala ta'itasi (meamata, "g" mo le AF488 ma le mumu, "r" mo Atto647N), na matou filifilia vaega o tului (ROIs) o lo'o i ai matāua, va'a, po'o togi (Ata Fa'aopoopo 1). ).8b) ma maua mai e ala i le fa'apipi'iina o le pala i le olaga atoa (τD, τR ma le τP mo matāua, va'a po'o togi, va'ai Fa'aopoopo Ata 8c) i alalaupapa ta'itasi e fa'aaoga ai se su'esu'ega e fetaui ma si'usi'u ma se fa'ata'ita'iga pala e lua vaega.averesi τ mai le τ .ROI na tele naua photon na maua mo le tele-exponential fetaui na le aofia ai mai le auiliiliga.O le tipi na fa'aaogaina e <104 photons mo va'a ma togitogi ma le 103 mo matau'a.O matāua e iai le pito i lalo ona e faigata ona maua ni pi'o pala ma le maualuga o le malosi, talu ai o matāua i le ata e masani lava ona la'ititi ma itiiti le tele.O ROI e iai le numera o le photon i luga a'e o le fa'aputuga o le photon (fa'atulaga i> 500 numera/pixel) na lafoa'i fo'i mo su'esu'ega.Faʻafetaui le faʻaogaina o le paʻu o le malosi na maua mai le itulagi o tului ma le malosi i le 90% o le maualuga (laʻititi pe a maeʻa le maualuga o le malosi o le pala) mai le amataga o le ola tautua ina ia faʻamautinoa le laʻititi o le faʻalavelave IRF aʻo faʻatumauina tutusa mo le malosi uma. fa'atulagaina Fa'amalama taimi feso'ota'i Sa su'esu'eina 25 i le 50 ROI mo va'a ma togi ma 15-25 ROI mo matau'a, ata filifilia mai le sili atu i le 4 kopi fa'amaumau mai le itiiti ifo i le 3 su'ega tuto'atasi.Na fa'aogaina su'ega-t-lua-tail e iloilo ai le eseesega o fuainumera i le va o ituaiga po'o le va o faiga fa'a-coacervate.Mo se su'esu'ega pixel-by-pixel o le olaga atoa (τ), o le aofa'i o le fa'aitiitia o le olaga i luga o le fanua mo alalaupapa ta'itasi na fa'atatauina ma fa'ataunu'uina se fa'ata'ita'iga o se fa'ata'ita'iga fa'aletupe fa'atele e 2/3-vaega.O le fa'aitiitia o le olaga mo pika ta'itasi na fa'apipi'iina i le fa'aogaina o tau τ sa fa'atatau muamua, ma maua ai se ata pseudocolor FLIM fetaui.O le si'usi'u e fetaui i le olaga atoa e tutusa i ata uma o le ala lava e tasi, ma o pala taitasi e maua mai ai le tele o photons e maua ai se fetaui lelei.Mo su'esu'ega a le FRET, na filifilia pixels e ala i le fa'aogaina o le fa'amaulalo o le 100 photons, lea e ave fa'ailoga fa'ailoga (FBG) o le 11 photons.O le malosi o le fluorescence o alalaupapa taʻitasi na faʻasaʻoina e ala i faʻataʻitaʻiga faʻamaonia mea faʻasaʻo: 69 spectral crosstalk α o 0.004, faʻasaʻo β o le 0.0305, faʻamaonia lelei γ o le 0.517.Ole fua ole FRET ile maualuga ole pika e fa'atatau ile fa'aogaina ole fa'atusa lea:
lea o le FDD o le malosi o le fluorescence o loʻo matauina i le foaʻi (lanu meamata), o le FDA o le malosi o le fluorescence o loʻo matauina i le tali (mumu) alalaupapa i lalo o le faʻalavelave faʻafuaseʻi, ma le FAA o le malosi o le fluorescence o loʻo matauina i le tali (lanu mumu) alalaupapa i lalo o le faʻamalosi saʻo ( PIE).O lo'o va'aia le malosi o le fluorescence i le alalaupapa).
Tuu le 100 µl o vaifofo tali LLPS o lo'o iai le 25 µM monomeric Tau441 e le'i fa'ailogaina (fa'atasi pe leai fo'i le 25 µM αS) i totonu o le LLPS pa'u (fa'aopoopo e pei ona ta'ua i luga) i luga o le 96-well microplates e le fa'apipi'i fa'atasi ma le fa'apipi'i pepa fa'apipi'i ma le matāua fa'atutu na siaki e WF micros. paleni.i totonu ole 10 min.Ina ua maeʻa le 48 itula o faʻamaʻi i le vevela o le potu, na faʻamaonia le i ai o polotini rafts ma faʻailoga.Ona aveese lea ma le faaeteete o le vai i luga o va'a mai vaieli, ona faaopoopo lea o le 50 L o le fa'amama fa'a'ese'ese (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ma fa'asusu mo le 10 min.O le maualuga o le masima e fa'amautinoa ai o le a le toe faia le LLPS ona o le PEG o totoe, ma o fa'apotopotoga polotini e mafai ona faia e na'o feso'ota'iga electrostatic o le a fa'amavae.O le pito i lalo o le vaieli na va'aia ma le fa'aeteete i se pito o le micropipette ma ave le vaifofo i se vaieli gaogao.Ina ua maeʻa faʻataʻitaʻiga o faʻataʻitaʻiga ma le 50 μM ThT mo le 1 h, o le i ai o nofoaga tuʻufua na siakiina e le WF microscopy.Sauni sonicated αS fibrils e incubating 300 µl o se vaifofo 70-μM αS i PBS ma le pH 7.4, sodium azide 0.01% i le 37 °C ma le 200 rpm i luga o se lulu orbital mo 7 aso.O le fofo na faʻapipiʻiina i le 9600 × g mo le 30 min, o le pellet na toe faʻaleleia i le PBS pH 7.4 ma sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude i se Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibril samples fa'atasi ai ma se fa'avasegaga tutusa le lapopo'a o fibrils laiti.
Ole su'esu'ega a le FCS/FCCS ma le su'esu'ega fa'afeagai e lua-lanu (TCCD) na fa'atinoina ile MT200 taimi fa'ata'ita'i fa'afeoloolo fa'ama'i (Pico-Quant, Perelini, Siamani) na fa'aaogaina mo su'esu'ega fa'ata'ita'i FLIM-FRET e fa'aaoga ai le PIE mode.Ole malosi ole laser mo nei su'esu'ega na fa'aopoopoina ile 6.0 µW (481 nm) ma le 6.2 μW (637 nm).O le tu'ufa'atasiga o nei malosiaga leisa na filifilia e maua ai le malamalama tutusa mo pa'aga o fluorophores fa'aaogaina a'o ausia fua fa'atatau sili ona lelei ma aloese mai le fa'apogaitia ma le saturation.Na fa'atinoina uma fa'amaumauga ma au'ili'iliga i le fa'aogaina o le polokalame fa'apisinisi SymphoTime64 version 2.3 (PicoQuant, Perelini, Siamani).
O fa'ata'ita'iga o fa'aputuga αS/Tau tu'ufua e maua mai i le LLPS e fa'afefeteina ile fa'amama tu'ufua i le fa'atonuga monomolecular talafeagai (e masani lava o le fa'afefiloi 1:500, talu ai o fa'aputuga ua uma ona i lalo fa'atonuga pe a vavae'ese mai fa'ata'ita'iga coacervate).O fa'ata'ita'iga na fa'aoga sa'o i ie ufiufi (Corning, ISA) na mua'i fa'apipi'iina i se vaifofo BSA i le fa'atonuga o le 1 mg/mL.
Mo le su'esu'ega a le PIE-smFRET i le lanu meamata ma le mumu, na fa'aogaina ai le fa'amaulalo o le 25 photons e fa'amama ai fa'ailoga maualalo e mafua mai i mea e tutupu fa'atasi (ia maitauina e sili atu le aofa'i o monomers nai lo fa'ata'ita'iga tu'ufa'atasi pe a fa'atusatusa i vaega tu'ufua).O lenei fa'ailoga na fa'atatauina e fa'alima taimi le mamafa o le monomeric αS na maua mai i le su'esu'eina o fa'ata'ita'iga o le monomer mama ina ia mafai ai ona filifili fa'apitoa fa'atasiga mo su'esu'ega.O le ta'amilosaga ta'avale a le PIE, fa'atasi ai ma le mauaina o fa'amaumauga a le TSCPC, ua mafai ai ona fa'aogaina se fa'amama mamafa o le olaga atoa e fesoasoani e fa'ate'aina tala'aga ma felafolafoa'iga.O le malosi o le mumu na filifilia i le faʻaogaina o pito i luga na faʻasaʻo i le faʻaogaina o le faʻailoga masani o tua na fuafuaina mai i histograms o mea na tutupu faʻatasi ma le malosi / pini o faʻataʻitaʻiga naʻo paʻu.O pa'u e feso'ota'i ma fa'aputu'e tetele e masani ona fa'amauina ni talone soso'o i le fa'asologa o le taimi (seti i le 1 ms).I nei tulaga, sa filifilia se pini e sili ona malosi.Mo suʻesuʻega FRET ma stoichiometric, na faʻaaogaina le gamma factor γ (0.517).Spectral crosstalk ma sao sa'o fa'afiafiaga e fa'atauva'a (fa'ata'ita'i fa'ata'ita'i) i le malosi leisa fa'aogaina.O le lelei ma le stoichiometry o le FRET i se pa ua fuafuaina e pei ona taua i lalo.
Taimi meli: Mati-08-2023