347 u'amea uamea vili fa'apa'u vaega vaila'au , Fa'ailoaina o tala fou interferon-tali tagata leukocyte antigen-A (HLA-A) chaperone polotini e fa'aaoga ai feso'ota'iga fa'ase'e tele spectrometry (CLMS)

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Fa'amatalaga o oloa

Uamea uamea 347L Coil Tubes, Vasega Uamea: SS347L

O le interferon signaling system e fa'aosoina ai se tali malosi cytokine i le tele o fa'ama'i fa'ama'i fa'ama'i ma totonugalemu mai le si'osi'omaga, e mafua ai le fa'aosoina o vaega laiti o polotini e mafai ona fa'aogaina interferon.Na matou faʻaogaina le DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) e suʻesuʻe ai fesoʻotaʻiga fou o porotini-porotini i le vaega o polotini e faʻaosoina le interferon.I le faʻaopopoga i le faʻamoemoeina o le interferon-inducible proteins, na matou faʻailoaina foʻi mea fou intermolecular ma intramolecular cross-linked addducts of canonical interferon-inducible proteins pei ole MX1, USP18, OAS3, ma le STAT1.Na matou taulaʻi atu i le faʻamaoniaga faʻapitoa o se seti fou o fesoʻotaʻiga protein interferon-inducible na fausia e HLA-A proteins (H2BFS-HLA-A-HMGA1) e faʻaaoga ai le co-immunoprecipitation ma a latou suʻesuʻega atili e faʻaaoga ai le molecular dynamics modeling.O le faʻataʻitaʻiga o le faʻaogaina o le malosi o le protein complex na faʻaalia ai le tele o fesoʻotaʻiga nofoaga e atagia ai fegalegaleaiga na faʻaalia i suʻesuʻega a le CLMS.Faʻatasi, matou te tuʻuina atu se suʻesuʻega pailate o le CLMS e faʻailoa ai faʻailoga fou faʻapipiʻi faʻaosoina e le interferon, ma tulimatai atu i le faʻaogaina lautele o le CLMS e iloa ai le malosi fou o fegalegaleaiga porotini i totonu o le microenvironment tumo.
A'o le'i amataina se tali fa'afoma'i fa'afoma'i, e fa'atūina e le 'au'aunaga fa'anatura se tali fa'ama'i e fa'atalanoaina e se aiga o fa'alifa-helical cytokines e ta'ua o interferons (IFNs).O le ituaiga I IFN vasega IFNα ma le IFNβ faʻagaoioia tali feaveaʻi, e aofia ai le antivirus, proapoptotic, proinflammatory, ma le antiproliferative states.I totonu o tagata, 13 subtypes o le IFNα ua iloa, faʻapipiʻi uma ile chromosome 91. O le mea e ofo ai, naʻo le IFNα2 na suʻesuʻeina mo le faʻaogaina o falemaʻi.Talu ai nei, na faʻapitoa le gauai atu i suʻesuʻega i isi vaega laiti ole IFNα.O se suʻesuʻega talu ai nei na faʻaalia ai o le IFNα14 o se tasi o isoforms sili ona aoga i le faʻasaʻoina o le HBV2 ma le HIV-13,4 faʻatusatusa i le canonical IFNα2 subtype.
Ua faʻamautuina o le faʻaogaina o le ituaiga I interferon receptor complexes (IFNAR1 ma le IFNAR2) e faʻaosoina ai se faʻasalalauga faʻasalalau faʻasalalau e Janus kinases TYK2 ma JAK15,6.O nei Janus kinases phosphorylate signal transducers ma transcriptional protein activators (STAT1 ma STAT2) i luga ole tyrosine toega e amata ai le SH2 domain-mediated heterodimerization6.Mulimuli ane, IRF9 fusifusia STAT heterodimers e fausia ai se faʻalavelave faʻalavelave o le IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), lea e faʻaliliu atu i le nucleus ma faʻaosofia le faʻaliliuga o le 2000 interferon-stimulated genes (ISGs) 5,6,7,8.
O le ISG e fausia ai le ivi tua o le tino puipuia, aemaise lava i le tali atu i osofaʻiga viral.I le avea ai ma laina muamua o le puipuiga mai faʻamaʻi viral, e faʻapipiʻi vave e sela le tele o fegalegaleaiga o polotini feaveaʻi ma le tele o gaioiga faʻaola.O nei polotini e aofia ai fa'ailoga e iloa ai mamanu, fa'ailoga mole, fa'asologa o tusitusiga, ma polotini fa'atasi ai ma galuega fa'ama'i sa'o, fa'apea fo'i ma ta'iala le lelei o tali puipuia9.Ole tele o fa'amatalaga ile gaioiga a le ISG e sau mai lau fa'aoga e fa'aogaina ai le overexpression screens10,11 po'o le gene silencing techniques (siRNA, RNAi ma CRISPR)12,13 lea e fa'aalia pe taofia ai ISG ta'ito'atasi ma fa'ata'ita'iina a latou gaioiga i siama eseese.E ui lava o nei suʻesuʻega na faʻamautu ai mea faʻamaʻi o ISG taʻitasi, o le faʻavae mole mole masini o ISG taʻitasi e tumau pea ona le iloa.E masani ona talia o le tele o polotini e fegalegaleai ma se tasi pe sili atu cytokines e faʻamautinoa ai le gaioiga atoatoa, o lea a le o le ISG e fegalegaleai saʻo poʻo a latou fegalegaleaiga e faʻatalanoaina e polotini feaveaʻi.Mo se faʻataʻitaʻiga, o se suʻesuʻega proteomics photocrosslinked talu ai nei na faʻaalia ai le ATPase VCP / p97 o se paaga fesoʻotaʻiga tele a le IFITM3, o lona faʻalavelave e oʻo atu ai i faʻaletonu i le lysosomal sorting, turnover, ma le cotransport o le IFITM3 faʻatasi ai ma viral particles 14.I le faʻaaogaina o le immunoprecipitation, matou te faʻaalia le VAPA, o se porotini e fesoʻotaʻi ma vesicle, o se paaga faʻatasi ma le IFITM1 / 2/3 e faʻasalalau le cholesterol-mediated viral maturation, ma na faʻamaonia e se isi suʻesuʻega e faʻaaoga ai se faʻafefete lua-hybrid system.Lagolago Faasaienisi 15 , 16 .
O se faiga fa'ale-aganu'u e a'afia i le taofiofia o fa'ama'i ma suiga leaga o le tu'uina atu lea o le antigen, lea e fa'atalanoaina e molela'au tele histocompatibility complex (MHC).Peptides (8-12 amino acids umi) mai le vavaeina, faʻamuta vave poʻo le misfolded proteins e utaina i totonu o le MHC-I heterodimer (e aofia ai MHC-I filifili mamafa ma mama, e taʻua o le β-2-microglobulin; β2M) 17,18.O mea e maua mai ai MHC-I trimers e feavea'i i luga o le sela, lea latou te tuuina atu ai peptides intracellular i sela CD8+ T (cell T cytotoxic)17.O sela T latou te iloa ma fa'aumatia nei fa'ama'i ma sela o lo'o tauaveina se antigen fa'apitoa ole tuma.O le mea la lea, o pathogens ma sela tumo e masani ona taofiofia le faagasologa o le tuʻuina atu o antigen e aloese ai mai le mataʻituina.E le gata i lea, o le MHC-I o loʻo faʻalaloina i le 40-90% o tuma o tagata ma e masani ona fesoʻotaʻi ma se faʻamaʻi leaga19.
O kenera o lo'o a'afia i le tali atu i fa'ama'i fa'ama'i e tatau ona vave fesuia'i i le va o se tulaga malolo ma se tulaga o lo'o galue fa'aliliu.O le mea lea, o le tele o polotini feaveaʻi o loʻo faʻamoemoeina e aʻafia i le tali atu i le maualuga o le IFN manaʻomia mo ni taimi pupuu, e aofia ai le toe faʻaleleia ma le fesuiaiga o le promoter chromatin 20,21.O le tele o suʻesuʻega na taulaʻi i le faʻamaoniaina o paaga ISG taʻitoʻatasi i le i ai o le IFN.O le tele o suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga ma transcriptomic i faʻataʻitaʻiga cell system ua faʻamalamalamaina le aʻafiaga o le IFN i luga o le laufanua feaveaʻi.Ae ui i lea, e ui lava i le faʻalauteleina o le malamalama i le malosi e faʻaosoina e interferons, e itiiti lava lo matou iloa e uiga i le auai o ISGs.Pe a mafaufau i le lavelave ma le fa'alagolago i le taimi ole fa'ailoga interferon, e lua fesili e tula'i mai: (i) e mafai ona fa'amautu ma maileia fa'alavelave fa'atele o lo'o a'afia i fa'ailo vave, ma (ii) e mafai ona fa'afanua nei feso'ota'iga ile avanoa 3D?
Ina ia foia nei mataupu, na matou faʻatinoina le succinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) faʻatasi ma le tele spectrometry (CLMS) e suʻesuʻe ai le IFNα-induced protein interaction network ma lona malosi.O le DSS e fa'aopoopoina so'o fa'atasi i le va o toega pito lata mai o polotini ma/po'o fa'apolotini lavelave i vivo.O le su'esu'ega a le MS e fa'aalia ai nofoaga fa'afeso'ota'i fa'apitoa e atagia ai le vavalalata fa'apitonu'u o itulagi i totonu o se porotini fa'apitoa, e ta'ua o feso'ota'iga i totonu, po'o vaega i totonu ole palatini lavelave, e ta'ua o feso'ota'iga.I le fa'aogaina o lenei faiga, ua matou iloa ai le tele o mea fou fa'akomepiuta-protein fa'alavelave fa'apea fo'i feso'ota'iga feso'ota'iga multiprotein fa'aoso interferon.E ala i le toe suʻeina o se vaega o nei fegalegaleaiga fou, matou te faʻaalia ai o le H2BFS (H2B histone-type FS; o loʻo taʻua mulimuli ane o le H2B) ma le MDN1 o loʻo galue o ni paaga faʻatasi mo HLA-A.
O sela Flo-1 o se tasi lea o faʻataʻitaʻiga e sili ona lauiloa i vitro o le adenocarcinoma esophageal aʻo latou faʻataʻitaʻiina foliga autu o le esophageal tumors22,23.Ae ui i lea, e le o tumo uma e immunogenic, ma ia iloa pe tali Flo-1 sela i togafitiga interferon, matou togafitia sela Flo-1 ma 10 ng / ml IFNα mo 72 itula.O sela Flo-1 na faʻaalia ai le amataga o le pSTAT1 ma le IRF1, amata 2 itula pe a maeʻa togafitiga ma faʻaauau mo 72 itula, faʻatasi ai ma le faʻaitiitia o le taimi faʻalagolago i tulaga faʻamau o IRF1 (Ata 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, ma le ISG15) na maua e faʻamalosia malosi i le maeʻa ai o itula 6, faʻataʻitaʻiina o tali masani i le ogatotonu ma le tuai o tali ile IFNα (Ata 1A).Faʻatasi, o nei faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai e mafai ona faʻaogaina lenei faʻataʻitaʻiga feaveaʻi e suʻesuʻe ai tali interferon.
Tali fa'amatalaga fa'apolotini eseese i sela Flo-1 ina ua mae'a togafitiga IFNα.(A) Faʻamatalaga porotini i sela Flo-1 na togafitia i le 10 ng / ml IFNα mo 2, 6, 24, 48 ma 72 itula na suʻesuʻeina e immunoblot e faʻaaoga ai faʻamaʻi ISG faʻaalia.(B) Coomassie lanu moana lanu SDS-PAGE gels o si'osi'omaga atoa pe a uma ona feso'ota'i ma le DSS mo taimi fa'aalia ma fa'atonuga.(C) Sui immunoblot su'esu'e ile p53(DO-1) antibody mai fa'ata'ita'iga tutusa e su'esu'e ai le maualuga ole feso'ota'iga porotini.
Ina ia pu'eina le laufanua o feso'ota'iga i totonu o le polotini, sa matou fa'aogaina le DSS, ose so'o feso'ota'iga lautele fa'aoga ona o le maualuga o le membrane ma le pu'upu'u le taimi e tali atu ai.Ole taimi ole tali pu'upu'u e fesoasoani e taofia ai le fa'atupuina o fa'aputuga tetele o polotini feso'ota'i, ma fa'atumauina ai le mautu o le feso'ota'iga.Ina ia iloa le sili ona lelei o le DSS ma aloese mai le soona faʻafesoʻotaʻi, matou te faʻaalia muamua sela i le 5, 2.5, ma le 1 mM DSS mo 5, 10, 5, ma le 30 minute, i le faasologa, ma suʻesuʻeina lysates e Coomassie-stained SDS-PAGE (faʻamatalaga e le o faʻaalia).Cell lysates e foliga mai e matua'i feso'ota'i fa'asagatau i le fa'atonuga maualalo ma i le taimi sili ona pu'upu'u.O le mea lea, DSS na titrated i le 1, 0.5, ma le 0.1 mM i luga ole 5 minute (Ata 1B).O fesoʻotaʻiga sili ona lelei na matauina i le 0.5 mM DSS mo minute 5, ma o nei tulaga na filifilia mo sela na togafitia i le IFNα.E le gata i lea, o le Ata 1C o loʻo faʻaalia ai se paʻu i Sisifo na faia i le faʻaaogaina o le p53 (DO-1) antibody e iloilo ai le maualuga o le fesoʻotaʻiga o le porotini.
Flo-1 sela na togafitia i le 10 ng / ml IFNα mo 24 itula aʻo leʻi faʻaopoopoina le crosslinker.O sela fesoʻotaʻi faʻasolosolo na sosoʻo mulimuli ane lysed e lua-laasaga proteolysis ma porotini na faʻagaioia e FASP (Fig. 2) 24,25.O peptides tryptic feso'ota'i fa'alava na su'esu'eina e ala ile tele spectrometry (Ata 2).Ole MS/MS spectra ona fa'afetaui lea ile faasologa ole porotini ma fa'atatau ile MaxQuant26,27.O peptide feso'ota'i fa'alava na fa'ailoaina mai le va'aiga na maua mai i le fa'aogaina o le polokalame SIM-XL, ma fa'apipi'i fa'atasi tagata ta'ito'atasi i se feso'ota'iga lavelave e fa'aaoga ai le xQuest28 ma le SIM-XL29 open source computing software pipelines (Fig. 2).O le SIM-XL o loʻo faʻaalia ai fesoʻotaʻiga protein-protein, filifili totonu ma filifili taʻitasi i faʻafefiloi faʻafefiloi faigofie pe lavelave ma tuʻuina atu faʻamatalaga mo le vaʻaia o fegalegaleaiga i totonu o fausaga polotini.E le gata i lea, o lo'o fa'avasegaina fa'asinomaga ta'itasi e fai ma sikoa ID e tusa ai ma le tulaga lelei ole alaleo MS/MS29.Le tele o fesoʻotaʻiga ma faʻalavelave faʻapitoa e faʻalagolago i le protein-protein ua faʻamaonia, ma o se seti fou o fegalegaleaiga ua toe suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le co-immunoprecipitation ma suiga faʻavae o faʻalavelave e faʻaaoga ai le molecular dynamics (MD) faʻataʻitaʻiga (Fig. 2) 30, 31.
Va'aiga fa'ata'ita'iga o le metotia CLMS.Flo-1 sela na togafitia i le 10 ng / ml IFNα mo 24 itula sosoo ai ma le in situ protein cross-linking e faʻaaoga ai le DSS sosoo ai ma le lysis cell ma trypsinization.Sa su'esu'eina fa'ata'ita'iga feso'ota'i fa'asaga i le fa'aogaina o le Orbitrap mass spectrometer ma fa'ata'ita'i atili mo le vaevaega o peptide precursors i le taimi o le LC-MS/MS.E lua peptides feso'ota'i na fa'ailoaina mai le alaleo na maua e fa'aaoga ai le Spectrum Recognition Machine o le Crosslinked Peptides (SIM-XL) polokalame, ma fa'afefiloi uma na tu'ufa'atasia i se feso'ota'iga lavelave e fa'aaoga ai paipa fa'akomepiuta.Fa'amama ese fegalegaleaiga maualalo e fa'atatau ile fua faatatau sese (FDR).O nisi o fesoʻotaʻiga fou-protein-protein maualuga-maualuga na faʻamaonia atili i le faʻaogaina o le co-immunoprecipitation, ma suiga faʻatulagaina i faʻalavelave faʻapitoa na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le molecular dynamics (MD) faʻataʻitaʻiga.
O le aofaʻi o le ~ 30,500 ma le ~ 28,500 peptides na maua i le faʻaaogaina o MaxQuant i faʻataʻitaʻiga IFNα e leʻi faʻaosoina ma faʻamalosia, taʻitasi (Tulafono Faʻaopoopo S1, Ata 3A).O le tufatufaina o le umi o le peptide i tulaga uma e lua na faʻaalia ai le maualuga o le tele o peptides tetele, e faʻaalia ai le i ai o peptides fesoʻotaʻi (Fig. 3B,C).E le gata i lea, o se vaega tele o peptides tetele sa i ai i le 40-55 laina i faʻataʻitaʻiga IFNα-treated (Fig 3C).O le faʻafanua o le polotini e faʻatatau i le log2 malosi na faʻaalia ai o polotini faʻamalosi faʻafefe-interferon e sili ona tele pe a faʻatusatusa i faʻataʻitaʻiga e leʻi togafitia, e aofia ai le MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, ma le HLA-F (Ata 3D).O suʻesuʻega o auala mo polotini e sili atu i le tolu-faʻatamaoaigaina i le tali atu i le togafitiga IFNα e faʻaaoga ai le Reactome pathway database na faʻaalia ai o le MHC-I-mediated antigen presentation and processing o le auala sili lea ona malosi (Ata 3E).E o gatasi ma lipoti muamua, o tali faʻamaʻi faʻasalalau e le OAS ma le ISG15 faʻapea foʻi ma le IFNα / β ma le cytokine faʻailoga o loʻo i totonu o auala faʻagaoioia.E le gata i lea, o le lysine- ma le serine-specific protein cross-links na iloa mai le MS / MS spectra na maua muamua e faʻaaoga ai le SIM-XL.O se su'esu'ega talu ai nei na lipotia ai le 104 ISGs e 20 viruses mai le 9 virus vasega e ala i meta-su'esu'ega o su'esu'ega fa'apea ISG ta'ito'atasi ile 5 ituaiga sela9.Ae ui i lea, ina ia faʻatoʻilaloina tapulaʻa faʻatusatusa o le suʻeina o faʻamaumauga tetele, na matou amata i se faʻamaumauga laiti e suʻesuʻe ai fegalegaleaiga talafeagai i le va o le lisi o genes IRDS na lipotia e Padaria et al., o le tele o ISGs.
Fa'ailoaina o polotini feso'ota'i fa'a'ese'ese fa'aalia i le tali atu ile IFNα (fa'amatalaga maua mai MaxQuant).(A) Venn diagram o loʻo faʻatusalia le numera o peptides masani ma faʻapitoa na faʻaalia i faʻataʻitaʻiga Flo-1 IFNα14 togafitia ma le togafitia.Tufatufaina umi peptide o fa'ata'ita'iga feso'ota'i feso'ota'i e le'i togafitia (B) ma le IFNα ua togafitia (C).(D) Fa'afanua vevela o lo'o fa'atusalia le log2 (LFQ malosi) i le va o le le togafitia ma le IFNα14 fa'aogaina Flo-1 sela.O le vaega agavale o loʻo faʻaalia ai polotini e sili ona faʻagaoioia i luma o le IFNα.(E) Histogram e fai ma sui o le 20 auala faʻatamaoaigaina tele ina ua maeʻa togafitiga IFNα.O le Reactome pathway database na suʻesuʻeina le sili atu ma le fa-faiga suiga i faʻatonuga IFNα-tali mai polotini.
O lo'o fa'amauina lelei le fa'aosoina o le ISG fa'asaga i le Interferon, ae i le tulaga mole mole e le'o malamalama lelei pe fa'apefea ona fa'ai'u nei polotini i le tele o galuega fa'aola.Na matou suʻesuʻeina fegalegaleaiga faʻapolotini ma se maualuga maualuga o le talitonuga i le va o ISGs ua iloa.O le mea e malie ai, na matou faʻaalia se fesoʻotaʻiga e aofia ai MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ma STAT1 proteins e fausia ai se lavelave tele i le tali atu i togafitiga IFNα (Ata 4, Laulau S2) 32,33,34.O le mea pito sili ona taua, o nei fegalegaleaiga na maua i triplicates uma na togafitia i le IFNα ma e leʻi maua i faʻataʻitaʻiga e leʻi togafitia, faʻapea na faia faʻapitoa i le tali atu i togafitiga IFNα.E iloa o le STAT1 transcriptionally faʻatonutonuina le faʻamatalaga o nei ISGs, ae o ana fegalegaleaiga ma ISGs i le protein level e leʻi suʻesuʻeina.O le fausaga tioata o le STAT1 na faʻaalia ai e le o aofia ai lona vaega helical domain (CCD) i fegalegaleaiga ma DNA poʻo protomers i le taimi o le faʻavaeina o dimers35.O nei α-helices e fausia ai se fausaga helical helix e maua ai se vaega sili ona maualuga hydrophilic mo fegalegaleaiga e tutupu 35 .I a matou faʻamatalaga CLMS, matou te matauina o le tele o fegalegaleaiga ma STAT1 na tupu i le SH2 domain i luma atu o le CCD, o le fesoʻotaʻiga, poʻo le siʻusiʻu C-terminal (toega 700-708) (Ata 4A).O se suʻesuʻega talu ai na lipotia mai o le USP18 e fusifusia i le CCD ma le DNA-binding domain (DBD) o le STAT2 ma faʻapipiʻiina i le subunit o le ituaiga I interferon receptor IFNAR2 e faʻasalalau le faʻalavelave o le ituaiga I interferon signaling 24.O a matou faʻamatalaga na faʻaalia ai foi o le USP18 catalytic domain e fegalegaleai ma STAT1 DBD (Ata 4A, D), o loʻo fautua mai ai e mafai e le STAT1 ma le STAT2 ona faia se sao i le faatosinaina o le USP18 i le IFNAR2.
Polotini-protein ISG fesoʻotaʻiga faʻaalia i sela fesoʻotaʻi fesoʻotaʻi na togafitia i le IFNα.(A) 2D fefaʻatauaʻiga faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia ai fesoʻotaʻiga polotini-porotini (faia i le polokalame SIM-XL), faʻatasi ai ma laina e fai ma sui o fegalegaleaiga intermolecular (crosslink cutoff set to 3.5).Fa'ailoga o fa'asinomaga 'ese'ese e fa'ailogaina i latou lanu32: MX1 domain, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), ma le GED (569–660).OAS3 vaega: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ma OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ma le fn3 (777–864).STAT1 fanua: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ma STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Tagata va'ava'ai fa'atasi o polotini feso'ota'i (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ma le STAT1) fa'atasi ai ma feso'ota'iga ma feso'ota'iga ua fa'ailogaina i le lanumoana ma le mumu.O le faʻamaufaʻailoga fesoʻotaʻiga na faʻatulagaina i le 3.5.O fa'ailoga togitogi o lo'o fa'aalia ai nofoaga o feso'ota'iga STAT1 ma MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ma le OAS3 (F), fa'apea fo'i ma nofoaga o feso'ota'iga K po'o S i le va o peptide e lua.I le fa'atusa, ua fa'atulaga le sikoa sikoa fa'alava i le 3.0.(G) Fesoʻotaʻiga nofoaga eseese i le va o STAT1 ma OAS3 DI domains faʻapipiʻiina i luga o latou fausaga porotini i PyMol (PyMOL molecular graphics system, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ma le OAS3 (pdb id: 4s3n34).) polokalame.
E lua isoforms o le USP18 ua faʻamatalaina i totonu o tagata, o se porotini umi-umi e tele lava i totonu o le nucleus, ma se isoform e aunoa ma se N-terminal domain, USP18-sf, lea e tufatufa tutusa i le cytoplasm ma le nucleus 36 .E le gata i lea, o le N-terminus na valoia e le faʻatulagaina ma e le manaʻomia ai le isopeptidase gaioiga poʻo le ISG1537 fusifusia.O le tele o fesoʻotaʻiga na faʻaalia i la matou suʻesuʻega sa i ai i le N-terminus o le polotini, e faʻapea o nei fegalegaleaiga e aofia ai le USP18 atoa (Ata 4A, D) ma faʻapea e tupu i totonu o le nucleus.E le gata i lea, o matou faʻamaumauga foi o loʻo faʻaalia ai o le N-terminus e faʻapitoa mo fegalegaleaiga protein-i-protein.O le nofoaga faʻapipiʻi IFNAR2 o loʻo i ai i le va o toega 312-368, ma faʻapitoa, e leai se polotini i totonu o le lavelave e fusifusia i lenei itulagi (Fig. 4A) 37,38.O nei faʻamaumauga tuʻufaʻatasia o loʻo faʻaalia ai o le IFNAR2 binding domain e faʻaaogaina naʻo le porotini tali.E le gata i lea, na o le OAS3 ma le ROBO1 na maua e fesoʻotaʻi ma vaega i luga o le N-terminus ma le IFNAR2 faʻapipiʻi nofoaga (Ata 4A).
ROBO1 e a'afia i le immunoglobulin (Ig) superfamily o molelaula faailoilo transmembrane ma e aofia ai le lima Ig domains ma tolu fibronectin (Fn) domains i le itulagi extracellular.O nei vaega fa'aopoopo e soso'o ai ma se eria membrane-proximal ma se tasi transmembrane helix 39. O se vaega intracellular e le'i fa'atulagaina o lo'o i le C-terminus ma o lo'o i ai ni fa'asologa fa'apolopolo fa'apolopolo e fa'afeso'ota'i effector protein binding39.O le itulagi e faʻalautele mai amino acids ~ 1100 i le 1600 e tele lava faʻalavelave.Na matou iloa o le MX1 e fegalegaleai ma ROBO1 e ala i Ig, Fn, ma intracellular domains, ae o le tele o fegalegaleaiga ma STAT1 e tupu i le va o le CCD, linker domain, ma le C-terminus o ROBO1 (Fig. 4A, E).I le isi itu, o fegalegaleaiga ma le DI, DIII, ma le OAS3 fesoʻotaʻiga itulagi na tufatufa atu i le ROBO1 protein (Fig 4A).
O le oligoadenylate synthase (OAS) protein aiga talia ma fusifusia intracellular double-stranded RNA (dsRNA), faia suiga conformational, ma synthesizes oligoadenylates fesootai 2′,5′ (2-5 As) 40 .Na maua i totonu o le tolu OASs, o le OAS3 o loʻo faʻaalia le maualuga maualuga mo le dsRNA ma faʻapipiʻi le itiiti ifo o le 2-5 As, lea e mafai ona faʻagaoioia RNase L ma faʻagata ai le faʻasologa o viral 41.O le aiga OAS e aofia ai polymerase beta (pol-β)-pei o nucleotide transferase domains.O suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai o le gaioiga faʻamalosi o le C-terminal domain (DIII) e faʻalagolago i le dsRNA-binding domain (DI), lea e manaʻomia mo le faʻagaoioia o le OAS342.Na matou matauina o le DI ma le DII domains o le OAS3 e fegalegaleai ma CCD ma se vaega laʻititi laʻititi i le va o SH2 ma STAT1 TAD (Ata 4A, F).O le faʻapipiʻiina o nofoaga faʻafesoʻotaʻi eseese i luga o le fausaga o le porotini na faʻaalia ai se fegalegaleaiga i le va o le β-pepa ma le DBD STAT1 matasele ma se taga matala poʻo se pu na faia e toega 60-75 i le DI domain o le OAS3 (Fig. 4G).O le faʻatulagaina o polotini i totonu o le faʻalavelave faʻapitoa na faʻaalia ai foi e leai se tasi o fegalegaleaiga ma le OAS3 na faʻalavelaveina le gafatia o le DNA o lona DI domain (Fig. S1A).E le gata i lea, o le N-terminal domain o GTPase MX1 e fegalegaleai tele ma le DI ma le DIII domains o le OAS3 (Fig. 4A).Na matou matauina foi se fegalegaleaiga i le va o le OAS1 ma le MX1 i le tolu IFNα-togafitiga toe fai, lea na fegalegaleai ai se vaega ole OAS1 e tasi (faʻapea foi le catalytically active) ma vaega uma e tolu MX1 (Ata S2A,B).
O polotini MX o se vaega o se aiga tele o dynein-pei o GTPases o loʻo i ai le N-terminal GTPase domain e fusifusia ma faʻafefeteina le GTP, o se vaega vavalalata e faʻatalanoaina le tagata lava ia, ma le C-terminal leucine zipper e galue o se GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.O le MX1 e fusifusia i vaega laiti o polymerases viral e poloka ai le tusiaina o le gene viral43.O se faʻafefete faʻafefete lua-hybrid screen na faʻaalia ai o le PIAS1 e fesoʻotaʻi ma le MX1 e taofia ai le STAT1-mediated gene activation e ala i le polokaina o le DNA-binding activity ma e iai foʻi le SUMO E344,45 ligase activity.O iinei, matou te faʻaalia ai o le MX1 e fusifusia i le STAT1 (Ata 4C, D), peitaʻi pe faʻafefea ona aʻafia e lenei fegalegaleaiga le STAT1-mediated gene activation i le tali atu i le IFNα e manaʻomia nisi suʻesuʻega.E le gata i lea, na matou iloa foi o le MX1 na fegalegaleai ma le IFIT3 ma le DDX60 i le tolu IFNα-togafitiga toe fai (Fig. S2C).
DDX60 o se IFN-induced cytoplasmic helicase lea na lipotia muamua e faia se sao i le RIG-I-tutoatasi faʻaleagaina o viral RNA46.E fegalegaleai ma le RIG-I ma faʻagaoioia lona faʻailoga i se faiga faʻapitoa 46. DDX60 e aofia ai le DEXD / H-Box helicase domain ma le C-terminal helicase domain e fusifusia viral RNA ma DNA47.O le tele o ana fegalegaleaiga ma le MX1 ma le IFIT3 e tupu i totonu ole N- ma C-terminal eria e aunoa ma ni fa'aupuga po'o ni fa'ailoga (Fig. S2E,F).Ae ui i lea, MX1 e fesoʻotaʻi foi ma le DEXD / H-Box helicase domain (Fig. S2E).O polotini a le aiga IFIT e iai ni kopi fa'atasi o se fa'ailoga iloga helix-turn-helix e ta'ua o le tetrapeptide repeat (TPR).Na maua le IFIT3 o se faʻaogaina lelei o le RIG-I faʻailoga ma o se vaega o le MAVS faʻalavelave.Faʻatasi, o matou faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o le IFIT3 ma le DDX60 e fegalegaleai muamua i le itulagi i le va o TPR 3-6 o le IFIT3 ma e mafai ona faia se sao i le RIG-I / MAVS faʻailoga (Fig. S2F).
Ona o le suʻesuʻeina o le proteome atoa e malosi faʻatusatusa, ona matou suʻeina lea o le tagata UniProt database mo le iai o se tasi o le IFNα-togafitiga toe fai.I lenei fa'atusa, na matou maua ai le tele o feso'ota'iga fa'atuatuaina mo le HLA-A.O le suʻesuʻeina o auala porotini na faʻaalia e MS / MS spectra na faʻaalia ai o le MHC-I-based antigen processing ma le faʻaalia o le auala autu lea e faʻaosoina e le interferon (Fig. 3D).O le mea lea, na matou taulaʻi i le suʻesuʻeina o fesoʻotaʻiga polotini o molelaʻau MHC-I ma se maualuga maualuga o le faʻatuatuaina i faʻataʻitaʻiga fesoʻotaʻi uma.O le HLA e aofia ai le α1, α2 ma le α3 domains ma filifili mama, ma microglobulin β2 (β2m) o se protein chaperone tumau49.O le taimi lava e faʻapotopoto ai i le endoplasmic reticulum, HLA e le mautu pe a leai ni peptide ligands50.O le peptide-binding groove e fausia e le maualuga polymorphic ma le le faʻatulagaina α1 ma le α2 domains i le non-peptide form ma le laʻititi laʻititi polymorphic α351 domain.I le i ai o le IFNα, na matou iloa ai le lua HLA-A faʻalavelave: tasi e fegalegaleai ma HMGA1 ma H2B (Ata 5, Laulau S3) ma le isi e fegalegaleai ma MDN1, LRCH4 ma H2B (Ata 6).
IFNα fa'aosoina se feso'ota'iga feso'ota'iga HLA-A ma H2B (H2BFS) ma le HMGA1.(A) 2D fuafuaga (fausia i le SIM-XL software) o loʻo faʻaalia ai ituaiga eseese o fegalegaleaiga i le H2B-HLA-A-HMGA1 faʻalavelave: fesoʻotaʻiga (lanu moana), fesoʻotaʻiga (mumu) ma le soʻotaga tasi (uliuli)..O vaega o fa'asinomaga eseese o lanu fa'ailoga32: H2B (histone; 2–102) ma le MHC-I (MHC_1; 25–203, vaega C1; 210–290 ma MHC_I_C; 337–364).O le faʻamaufaʻailoga fesoʻotaʻiga na faʻatulagaina i le 3.5.Fa'ailoga togitogi o lo'o fa'ailoa mai ai nofoaga o feso'ota'iga HLA-A ma le H2B (B) ma le HMGA1 (C), fa'apea fo'i ma nofoaga o feso'ota'iga K po'o S i le va o peptide e lua.I le fa'atusa, ua fa'atulaga le sikoa sikoa fa'alava i le 3.0.(D) Soʻotaga i le va o polotini o loʻo faʻaalia i fausaga o le H2B, HLA-A, ma le HMGA1 proteins i le polokalame PyMOL.O nei fausaga na faʻataʻitaʻiina e faʻaaoga ai le Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ma faʻataʻitaʻiga fausaga mo le H2B, HLA-A ma le HMGA1 proteins o 1kx552, 1kj349 ma 2eze55, i le faasologa.
IFNα fa'aosoina se feso'ota'iga feso'ota'iga HLA-A ma H2B (H2BFS), MDN1 ma le LRCH4.(A) Intramolecular (mumu) ma intermolecular (lanumoana) crosslinks o loʻo tuʻuina atu i luga o se faʻafanua fesoʻotaʻi 2D (faia i le SIM-XL software) ma le MDN1 o loʻo faʻatusalia o se liʻo.O le faʻamaufaʻailoga fesoʻotaʻiga na faʻatulagaina i le 3.5.O vaega o fa'asinomaga eseese o lanu fa'ailoga32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, vaega C1; 210–290 ma MHC_I_C; 337–364) ma LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ma CH (535–641)).(B) Soʻotaga i le va o polotini o loʻo faʻaalia i fausaga o le H2B, HLA-A, LRCH4, ma le MDN1 polotini i le polokalame PyMOL.O nei fausaga na faʻataʻitaʻiina e faʻaaoga ai le Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) faʻatasi ai ma fausaga faʻataʻitaʻiga 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ma 6i2665 mo le H2B, HLA-A, LRCH4 ma MDN1 polotini, taitasi.Fa'ailoga togitogi o lo'o fa'aalia ai nofoaga o feso'ota'iga K po'o S mo HLA-A ma H2B (C), LRCH4 (D), ma MDN1 (E).Mo fa'ailoga, o le fa'amaufa'ailoga feso'ota'iga fa'ailoga na fa'atulaga ile 3.0.
I le faaopoopo atu i le faatumauina o le faamaoni o le genome, o le histone H2B e aofia ai foi i le faatonutonuina o tusitusiga.O le polotini H2B e aofia ai se vaega autu o talafaasolopito (HFD) na faia e tolu α-helice e vavaeeseina e alalaupapa ma se siʻusiʻu C-terminal 41,52.O le tele o fegalegaleaiga ma le H2B e tupu i le α1 helix, lea e maua ai le trimerization ma le HFD heterodimer (Fig. 5A, B).E ui lava o lysins o loʻo aʻafia i le DNA fusifusia, o nisi lysins o isi foi acetylation poʻo nofoaga methylation.Mo se fa'ata'ita'iga, o totoe K43, K46, ma le K57 mai le H2B e le'o a'afia i fa'amau tu'usa'o a le DNA, ae o fa'amoemoega o suiga eseese pe a mae'a fa'aliliu53.E faapena foi, o totoe K44, K47, ma K57 i le H2B e mafai ona faia se isi vaega i le i ai o le IFNα, e aofia ai fegalegaleaiga ma isi polotini (Fig. 5A, B).E le gata i lea, o le extrachromosomal histone H2B e faʻagaoioia le tali atu i totonu o ituaiga sela eseese, galue e pei o se cytosolic sensor e iloa ai fasi vaega DNA faʻalua (dsDNA) e maua mai i siama faʻamaʻi poʻo sela ua faaleagaina54.I le i ai o faʻamaʻi DNA, o le faʻaitiitia o le H2B na taofia ai le gaosiga o le IFN-β ma le STAT154 phosphorylation.H2B ua iloa foi e alu i totonu ma fafo o le nucleus e vave atu nai lo isi fa'asologa autu54.H2B fegalegaleai ma MDN1 ma LRCH4 sa maitauina foi i faʻataʻitaʻiga filifilia e leʻi togafitia.Na matou iloa o le HLA-A na fegalegaleai ma le H2B i faʻataʻitaʻiga uma e tolu na togafitia e le IFNα ma i se tasi faʻataʻitaʻiga toe fai.O nei faʻamatalaga e atagia ai le matafaioi a le H2B i se isi galuega faʻaletino e tutoʻatasi mai le faʻasologa o tusitusiga.
HMGA1 (vaega maualuga AT-Hook 1), o se tama'i nucleoprotein mauoa i fa'ama'i fa'aoso amino acids, ua fa'ailoaina i le feso'ota'iga ma le HLA-A.O lo'o i ai se si'usi'u C-terminal acid ma tolu DBDs ma'oti e ta'ua o matau AT aua latou te fusifusia i le tootoo la'ititi o le itulagi AT-mauoa i le dsDNA55,56.O le fusifusia lea e mafua ai ona punou pe fa'asa'o le DNA, ma fa'atagaina ai fa'amaumauga fa'a-canonical e maua ai le fa'asologa o maliega.O le siʻusiʻu C-terminal e talitonuina e aʻafia i fegalegaleaiga protein-protein ma le faʻafaigaluegaina o mea faʻaliliu, talu ai e le mafai e mutants tape C-terminal ona amataina le transcription57.E le gata i lea, o lenei vaega o loʻo i ai le tele o nofoaga faʻasaoina o le phosphorylation o loʻo lauiloa mo kinases 58.Na matou matauina le HLA-A ma le H2B fegalegaleaiga ma le HMGA1 i fafo atu o le C-terminal domain, o loʻo fautua mai ai o le C-terminal domain e masani ona faʻaaogaina mo le transcription factor binding (Fig. 5A, C).O polotini HMGA e tauva ma histone H1 mo le fusifusia i le DNA fetuutuunai, ma faʻateleina ai le avanoa57.E faapena foi, e foliga mai o le HMGA e fegalegaleai ma le histone H2B i luga o le linker DNA i le tauvaga ma le histone H1.O le HMGB1 e faʻaosofia ai le faʻaalia o le HLA-A, -B, ma le -C i sela dendritic, e oʻo atu ai i lo latou faʻagaoioia59, ae o se fegalegaleaiga i le va o le HMG ma le HLA e leʻi lipotia muamua.Na matou iloa o le HMGA1 e fegalegaleai ma le α1 ma le α3 domains o le HLA-A, ma le tele o fegalegaleaiga i fafo atu o lona 3 DBD (Ata 5A, C).I o matou lima, na maua ai le HLA-A i totonu o le nucleus (faʻamatalaga e le o faʻaalia), ma tuʻuina atu o loʻo iai foi H2B ma HMGA1 i totonu o le nucleus, o lenei fegalegaleaiga e ono tupu i totonu o le nucleus.O faʻaopoopoga faʻapitoa e fuaina i le va o le H2B, HLA-A, ma le HMGA1 o loʻo faʻaalia i le Ata 5D.
O le tele o fegalegaleaiga a le HLA-A ma isi polotini e tupu i totonu o lona α1 ma le α2 domains ma le C-terminal domain disordered (Fig. 6).I se tasi o nei faʻataʻitaʻiga, na matou iloa ai o le HLA-A e fegalegaleai ma le faʻalavelave N-terminal siʻusiʻu o le LRCH4 (Ata 6A, D).LRCH4 faʻatonutonu le TLR4 faʻagaioiga ma le LPS cytokine induction, ma faʻafefea ai le faʻaogaina o le immune response60,61.O se porotini membrane e iva leucine-rich repeats (LRRs) ma le calmodulin (CH) motif homology i lona ectodomain, sosoo ai ma le transmembrane domain (TMD) 60, 62.CH domains ua lipotia mai e faʻatalanoaina fegalegaleaiga porotini-porotini 60 .O se fa'alautelega e tusa ma le 300 amino acids i le va o le LRR ma le CH domains e faigofie ona maua ae fa'aletonu.Faʻavae i luga o le galuega a itulagi faʻalavelave e pei o puluvaga o fesoʻotaʻiga protein-protein ma felauaiga vesicular 63, na matou iloa ai o le tele o fesoʻotaʻiga protein e tupu i totonu o itulagi faʻalavelave.Fegalegaleaiga ma MDN1 na tufatufa atu i le umi o le polotini, e aofia ai le LRR1, LRR6, CH domains, ma itulagi faʻafuaseʻi, ae o le H2B e masani ona fusia i le CH domain (Fig. 6A, B).E le gata i lea, e leai se tasi o fegalegaleaiga e aofia ai le TMJ, o loʻo fautua mai ai le faʻapitoa o le CLMS auala (Ata 6A, B).
MDN1 ua faailoaina foi o se vaega o le HLA-A protein network (Ata 6A).E aʻafia i le aiga AAA o polotini (ATPases e fesoʻotaʻi ma gaioiga eseese).Ole vaega lea ole N-terminal AAA e fa'apipi'i ile mama hexameric ma aveese le fa'apotopotoga mai le 60S 64 ribosomal subunit.e foliga mai e tutusa ma le dynein64,65,66.E le gata i lea, o le itulagi mauoa Asp/Glu e mulimulitaia e le MIDAS domain (metal ion dependent site).Ona o le tele o le MDN1 (e tusa ma le 5600 amino acids) ma lona faʻatapulaʻaina homology faʻatasi ai ma polotini suʻesuʻeina lelei, e itiiti se mea e iloa e uiga i lona fausaga ma galuega i tagata.Na matou faʻailoaina HLA-A, H2B, ma LRCH4 o MDN1 paʻaga faʻatasi ma faʻaalia lo latou faʻataʻitaʻiga o mea faʻapipiʻi protein i PyMol (Fig. 6A,B).O nei polotini e tolu e fegalegaleai ma le AAA domain, le dynein-like linker domain, ma atonu o le MIDAS MDN1 domain.I se lipoti talu ai, o le faʻamamaina o le faʻamamaina o maunu na iloa ai le MDN1 o se porotini e fesoʻotaʻi ma le histone H2B67.E le gata i lea, o se suʻesuʻega talu ai nei na lipotia mai ai foi se fegalegaleaiga i le va o le MDN ma le HLA-B i le HCT116 sela e faʻaogaina ai le vaʻaia-faʻamamaina o le tele o spectrometry, lagolagoina a matou sailiga68.O le faʻamaoniaina o lenei faʻalavelave i faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga IFNα e taʻu mai ai se matafaioi mo le MDN1 i le interferon signaling.
Talu ai ona o genes HLA e sili ona polymorphic, na matou aumaia fa'asologa faitau fa'afanua HLA-A, -B, ma -C mai fa'amaumauga fa'asologa o RNA o sela Flo-1 (fa'amatalaga e le o fa'aalia).Peptide fa'asologa e ogatasi ma le fa'asologa o faitauga na fa'aalia ai le tele o eseesega i le va o le HLA-A, -B, ma le -C i itulagi o lo'o i ai peptides feso'ota'i i le HLA-A (Ata S3).E le gata i lea, matou te leʻi matauina le fesoʻotaʻiga o le protein-i-protein o molelaʻau HLA-B / C ma H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 proteins.O lo'o fa'ailoa mai ai o feso'ota'iga polotini o lo'o maua i le va o le HLA-A, MDN1, LRCH1 ma le HMGA1 o le HLA-A fa'apitoa.E le gata i lea, o suʻesuʻega proteomic o faʻataʻitaʻiga e le o fesoʻotaʻi (Laulau S4) na faʻaalia ai o le HLA-A e maualuga atu le faʻasologa o faʻasologa faʻatusatusa i le HLA-B poʻo le HLA-C.O peptides na faʻamaonia mo le HLA-A na maualuga le malosi i faʻataʻitaʻiga IFNα-togafitia ma le le togafitia.
Ina ia mautinoa o fegalegaleaiga o loʻo faʻaalia iinei e leʻi mafua mai i le le faʻapitoa o fesoʻotaʻiga o palatini e lua i le vavalalata vavalalata, na matou faʻamaonia atili ai ni mea fou e lua o le HLA-A e fesoʻotaʻi ai e ala i le faia o suʻega faʻa-immunoprecipitation.O fesoʻotaʻiga a le HLA-A ma le MDN1 ma le H2B o loʻo maua i le IFNα-togafitiga ma le le togafitia o sela Flo-1 (Ata 7, Ata S4).Na matou faʻamaonia o le HLA-A na puʻeina e le H2B i le immunoprecipitates ma o lenei mafutaga na mafua ona o le IFNα togafitiga talu ai o le HLA-A na toesea i faʻataʻitaʻiga immunoprecipitate mai sela e leʻi togafitia (Ata 7A).Ae ui i lea, o matou faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o le IFNα e faʻatonutonu eseʻese le HLA-A faʻapipiʻi i le H2B ma le MDN1.O le IFNα e fa'aosoina le feso'ota'iga i le va o le H2B ma le HLA-A, ae fa'aitiitia lona feso'ota'iga ma le MDN1.Na matou iloa o le MDN1 e fesoʻotaʻi ma le HLA-A i faʻatonuga, ma o le faʻaopoopoga o le IFNα na faʻaititia ai lenei fegalegaleaiga tutoatasi mai le MDN1 induction e IFNα (Ata 7B, C).E le gata i lea, o le HLA-A immunoprecipitation na puʻeina le H2B i sela A549 (Fig. S4), o loʻo fautua mai ai o lenei fegalegaleaiga e tutoatasi mai le ituaiga sela.A tu'ufa'atasia, o nei taunu'uga e lagolagoina ai feso'ota'iga interferon-mediated a HLA-A ma H2B ma MDN1.
HLA-A fa'amama fa'atasi le H2B ma le MDN1.O sui o le H2B (A) ma le MDN1 (B) immunoblots na puipuia mai sela Flo-1 na togafitia IFNα ma suʻesuʻe mo faʻamaʻi faʻaalia.O le isumu ma le lapiti IgG na faʻaaogaina e fai ma pule le lelei.(C) Ole aofa'i (fa'aofi) o antigens 'ese'ese o lo'o fa'aalia e immunoblots su'esu'e fa'asaga i fa'ama'i fa'ailoa, β-actin na fa'aaogaina e fai ma fa'atonuga o uta.
O meatotino faʻavae o se tasi o fesoʻotaʻiga fesoʻotaʻiga fesoʻotaʻiga sili ona faʻatuatuaina interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, na suʻesuʻeina.Na matou faʻaogaina le faʻataʻitaʻiga o le molecular dynamics e avea o se isi auala e malamalama ai i le faʻaogaina o le malosi o polotini o loʻo aʻafia i lenei lavelave (Ata 8).O fa'amatalaga mai fa'amaumauga a le CLMS o lo'o fa'ailoa mai ai le fa'atupuina o suiga eseese ole palatini H2B, HLA-A, ma le HMGA1.O le mea lea, o faʻalavelave faʻapitoa nei na faʻataʻitaʻiina i se auala solvent: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ma le H2B-HLA-A-HMGA1.O se ata muamua o le polotini-protein docking screen e faaaoga ai le MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) na fautuaina mai ai ni fetuunaiga talafeagai e eseese i le va o nei polotini (Fig. 8A).O le va'aiga o le fa'apipi'iina o le polotini fa'apipi'i na fa'aalia ai le tele o feso'ota'iga ma fa'atonuga talafeagai (Ata 5A, 8).O le mea lea, o le tasi faʻasologa e mafai ona faʻaalia i le Ata 8A (faʻatasi ai ma faʻamaufaʻailoga fesoʻotaʻiga) ma sa toe iloiloina e faʻaaoga ai le MD modeling pipeline.E le gata i lea, o le fusia o le H2B poʻo le HMGA1 i le HLA-A o loʻo faʻamaonia ai le maualuga maualuga o le H2B mo HLA-A (Fig 8A).
Conformational dynamics o fesoʻotaʻiga talafeagai i le va o H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, ma H2B-HLA-A-HMGA1 faʻalavelave.(A) O le vaega agavale o se fa'afanua 2D (fa'atupuina i le polokalama SIM-XL) o feso'ota'iga intramolecular (mumu) ma intermolecular (lanumoana) (fa'apipi'i cutoff crosslink i le 3.5).E le gata i lea, o toega o fesoʻotaʻiga faʻasolosolo ua iloa o loʻo faʻailogaina i luga o fausaga o le H2B, HLA-A, ma le HMGA1 proteins.O feso'ota'iga feso'ota'iga o nei polotini na maua mai i le fa'aogaina o le paipa fa'apipi'i fa'atino i totonu o le afifi MOE.O le vaega agavale pito i lalo o loʻo faʻaalia ai le tele o faʻaputuga o le H2B-HLA-A ma le HMGA1-HLA-A faʻatasi ma faʻatasiga faʻapipiʻi porotini-porotini (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Va'aiga masani (RMSD) o tulaga atomika (e le aofia ai hydrogen atoms) mo fausaga porotini ta'itasi.(C) Intermolecular porotini-protein hydrogen sootaga sootaga mai faʻalavelave faʻataʻitaʻiga eseese mafaufau i fegalegaleaiga patino o le umi ≥ 10 ns.O le mamao o le vavaega o le foaʻi-H-acceptor na tuʻuina i le 3.5 Å, ma le faʻaputuina o le faʻailoga o le foaʻi-H-acceptor i le ≥ 160 °-180 °.(D) Fa'ailoga toega o lo'o fausia ai le HLA-A protein-protein fegalegaleai ma a latou pa'aga ta'itasi, e ≥ 20 ns, fa'asolo mai i dummy HLA-A-H2B ma HLA-A-HMGA1 lavelave.O fausaga o porotini e fai ma sui o se fausaga masani o le 100 ns MDS.(E) Fesoʻotaʻiga i le va o HLA-A-H2B ma HLA-A-HMGA1 faʻatusatusaga faʻatusatusa i fesoʻotaʻiga e siakiina e le H2B-HLA simulation i luga ole 100 ns faʻavae i luga ole K poʻo S fesoʻotaʻiga nofoaga i le va o peptides e lua.Fa'alavelave /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.O le tau o le faʻailoga mo le iloiloga o fesoʻotaʻiga fesoʻotaʻiga na faʻatulagaina i le 3.0, ma o fegalegaleaiga faʻapitoa mai le MDS ave ≥ 10 ns na faʻaaogaina.O fausaga o porotini na faʻaalia i le faʻaaogaina o BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, ISA) ma Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanata) afifi.
O le mautu o molelaʻau HLA-A i le taimi (tulaga masani; RMSD poʻo le faʻasologa masani; RMSF) na faʻaalia ai o le i ai o le H2B poʻo le HMGA1 proteins i totonu o faʻalavelave faʻamautu le HLA-A (Ata 8B, Ata S5).O le HMGA1 protein e fusifusia mau i le B2M site o le HLA-A, faʻaosofia le mautu o le HLA-A amino acids i le HLA-A-HMGA1 poʻo le H2B-HLA-A-HMGA1 complex (Ata 8B, Ata S5).aemaise lava, o totoe o le HLA ~ 60-90 ma ~ 180-210 na maua e le mafai ona faʻaogaina i le i ai o le H2B (FIG. 8B).O le H2B ma le HMGA1 na faʻaalia le sili atu o le fusifusia i le HLA-A i le H2B-HLA-A-HMGA1 faʻatusatusa i le HLA-A o loʻo fusifusia i le H2B poʻo le HMGA1 naʻo (Ata 8C, D; Laulau S5).Toega o loʻo aʻafia i le faʻapipiʻiina o le hydrogen (MD faʻataʻitaʻiina le maualuga o le nofoia ≥ 10 ns) e fetaui lelei ma nofoaga o fesoʻotaʻiga CLMS (K poʻo S toega) i totonu o le faʻalavelave, e faʻaalia ai o fesoʻotaʻiga faʻaalia e CLMS e matua faʻatuatuaina.Fa'atuatuaina (Ata 8E).I le CLMS ma le MD faʻataʻitaʻiga, o totoe HLA-A i le va o le 190-210 ma le 200-220 amino acids na maua e fusifusia ai H2B ma HMGA1, i le faasologa (FIG. 8E).
O fesoʻotaʻiga a le protein-protein e fausia ai fesoʻotaʻiga faʻavae malosi e faʻatautaia fesoʻotaʻiga intracellular e tali atu ai i nisi faʻaosofia.Talu ai ona o le tele o auala proteomics e iloa ai suiga i le tulaga mautu atoa o se porotini, e manaʻomia ai le faʻaogaina o fesoʻotaʻiga polotini-protein mea faigaluega faʻaopoopo e puʻeina ai fesoʻotaʻiga, ma o le CLMS o se tasi o meafaigaluega.O le interferon signaling system o se fesoʻotaʻiga cytokine lea e mafai ai e sela ona tali atu i le tele o faʻamaʻi faʻamaʻi pipisi o le siosiomaga ma faʻamaʻi pipisi, faʻamaeʻaina i le faʻauluina o vaega o palatini interferon-inducible.Na matou fa'aogaina le CLMS e iloa ai pe mafai ona iloa ni feso'ota'iga fou-protein-protein i totonu o se vaega o polotini fa'aoso interferon.O su'esu'ega feso'ota'iga feso'ota'iga o porotini i le lalolagi i se fa'ata'ita'iga sela Flo-1 tali-interferon na fa'aaogaina e pu'e ai fa'apolotini lavelave.O le aveeseina o peptides tryptic mai sela e le o feso'ota'i ma feso'ota'i fa'asagatau e mafai ai ona faitau peptide, fa'atamaoaigaina o le ala, ma le tufatufaina o le umi ole peptide fa'atasi ai ma le malosi ole LFQ.Canonical interferon-inducible proteins na faailoaina o se pulea lelei i totonu, ae o le intermolecular ma intramolecular cross-linked adducts fou o polotini interferon-inducible canonical e pei ole MX1, UP18, OAS3 ma le STAT1 sa matauina.Ua su'esu'eina uiga fa'atulagaina ma feso'ota'iga i vaega fa'atino.
O se fegalegaleaiga i le va o le HLA-A, MDN1 ma le H2B na maua i le immunoblotting i sela Flo-1 ma A549 na togafitia ma le togafitia i le IFNα.O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻamaonia ai o le HLA-A faʻatasi ma le H2B i se IFNα faʻalagolago.O la matou galuega e fai ma sui o se auala manaia mo le suʻesuʻeina atili o le faʻaogaina o nei faʻalavelave e lua.E manaia foi le faʻalauteleina o le auala CLMS i se laulau o laina sela e faʻamaonia ai fesoʻotaʻiga protein interferon-mediated cell-type-independent interferon.Mulimuli ane, na matou faʻaogaina le MD faʻataʻitaʻiga e fai ma isi auala e malamalama ai i le faʻaogaina o le faʻaogaina o polotini o loʻo aʻafia i le H2BFS-HLA-A-HMGA1 faʻalavelave, lea e siaki ai le intramolecular ma intermolecular cross-talks.O fa'amatalaga mai fa'amaumauga a le CLMS o lo'o ta'u mai ai le ono mafai ona fa'atutusa ese'ese ole palatini H2BFS, HLA-A, ma le HMGA1.O suiga eseese e ono mafai ona fai i le va o lavelave polotini fa'apipi'i na fa'aalia ai le tele o feso'ota'iga tutusa ma mea o lo'o matauina i le CLMS dataset.O se tasi o malosiaga autu o la tatou metotia o le mafai lea ona faigofie ona iloagofie o fegalegaleai maualuga polymorphic genes e pei ole HLA, o lea o le a manaia ai le suʻesuʻeina o fegalegaleaiga a le HLA haplotype-specific proteins e faigata ona suʻesuʻe.Faʻatasi, o matou faʻamaumauga e faʻaalia ai e mafai ona faʻaogaina le CLMS e faʻalautele ai lo matou malamalama i fesoʻotaʻiga faʻailoga faʻapipiʻi-interferon ma tuʻuina atu se faʻavae mo le suʻesuʻeina o faiga faʻafesoʻotaʻi faʻalavelave i le microenvironment tumo.
Flo-1 sela na maua mai le ATCC ma tausia i le DMEM (Gibco) faaopoopo i le 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen), 10% fetal bovine serum (Gibco) ma teuina i le 37 ° C ma le 5% CO2.Incubation.O sela na tupu aʻe i le 70-80% faʻafesoʻotaʻi aʻo leʻi togafitia i le IFNα14 (faia e Edinburgh Protein Production Facility).O isi vaila'au uma ma reagents na fa'atau mai Sigma Aldrich se'i vagana ua fa'ailoa mai.
Flo-1 sela na faʻatupuina i 6-well plates ma o le aso na sosoo ai na togafitia ai sela i le 10 ng / ml IFNα14 mo le 24 itula e tusa ma le 80% faʻatasi.O sela na fufulu faatolu i le PBS ma faʻapipiʻiina i le DSS fou saunia (Thermo Fisher Scientific) (faʻamavae i DMSO) i le PBS mo le 5 min i le 37 ° C. i se faʻasalaga mulimuli o le 0.5 mM.O le DSS crosslinking reaction na suia i le PBS ma le DSS totoe na tineia e ala i le faʻaopoopoina o le 20 mM Tris (pH 8.0) i le PBS mo le 15 min i le 37 ° C.Na aoina sela e ala i le solo ma aoina i totonu o paipa maualalo (Axygen).
O le pellet cell sa fa'amama i le 300 µl o le urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) mo le 30 min i le vevela o le potu ma luluina i nisi taimi.O laasaga uma centrifugation na faia ile 14,000 xg ile 8°C.Centrifuge le lysate mo le 10 minute ma faʻafeiloaʻi le supernatant i se paipa fou.O vaega manino na totoe na faʻamavaeina i le 150 μl o le paʻu lysis lona lua (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) mo le 30 minute pe sili atu seia oʻo ina maua se vaifofo tutusa.O le lysate sa centrifuged mo le 20 minute ma faʻafefiloi le supernatant ma le lysate na maua i le laasaga muamua.Sa su'esu'eina le fa'aogaina o polotini e fa'aaoga ai le su'esu'ega a le Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) e tusa ai ma fa'atonuga a le gaosi oloa mo fa'asologa o microplate.O fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'i na vave fa'aaisa i le vai o le nitrogen ma teu i le -80°C.
E tusa ma le 100 μg ole polotini soluble crosslinked sa fa'aogaina ile fa'aogaina o se fa'asologa o sauniuniga fa'ata'ita'iga (FASP) ua suia e pei ona fa'amatalaina e Wisniewski et al.69 Fa'apuupuu, o le polotini e feso'ota'i ma le 200 µl o le urea buffer (8 M urea i le 0.1 M Tris, pH 8.5), vortex ma afa.O laasaga uma centrifugation na faia ile 14,000 xg ile 25°C.O le afa muamua o le lysate protein fesoʻotaʻi faʻasolosolo na faʻafeiloaʻi i se masini faʻamama 10 kDa Microcon centrifugal faʻapipiʻiina i le Ultracel-10 membrane (Merck), sosoo ai ma le centrifugation i luga o le faamama mo le 25 minute.Ona faaopoopo lea o le afa lona lua o le polotini i le faamama ma toe fai laasaga lava e tasi.O le toe faʻaleleia o le polotini na faia e ala i le faʻaopoopoina o le 100 μl o le 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) i totonu o le urea buffer.Toe faʻaleleia na faʻaosoina i luga o se thermomixer i le 600 rpm mo le 30 minute i le 37 ° C.E le gata i lea, o le koluma na centrifuged ma o le faʻaitiitia o le faʻauluina o le porotini fesoʻotaʻi sa alkylated e faʻaaoga ai le 100 μl o le 50 mM iodoacetamide i le urea buffer.Ole tali alkylation na faia ile vevela ole potu mo le 20 minute ile pogisa.Ta'amilo le koluma, fufulu puipui fa'atolu fa'atasi ma le 100 µl urea buffer, ona fa'amama lea.O le gaioiga lava lea e tasi na faia fa'atolu i le fa'aaogaina o le 100 μl o le 100 mM ammonium bicarbonate.A'o le'i faia le trypsinization, sui le paipa fa'aputu i se mea fou.Fa'aopoopo le fa'apalapala fa'alaufau o lo'o iai le 50 mM ammonium bicarbonate ma le 1 µl trypsin fa'afefeteina ile trypsin buffer (Promega).O le fua faatatau o le trypsin i le polotini na tausia i le tusa o le 1:33, ma faʻafefete faʻafefeteina na faʻafefe i le po i le 37 ° C. i totonu o se potu susu.O le peptide fa'afeso'ota'i na fa'amama ese mai le fa'amama e ala ile centrifugation mo le 25 minute.Na faʻaleleia le toe faʻaleleia o le peptide e ala i le faʻaopopoina o le 50 μl o le 0.5 M NaCl i le faamama, sosoo ai ma le centrifugation mo le 25 minute.
C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) na faʻaaogaina e faʻamalo ai peptides tryptic fesoʻotaʻi faʻasolosolo e mulimuli i le faʻasalalauga faʻamatalaina e Bouchal et al.70 faʻatasi ai ma suiga laiti.I se faapuupuuga, na faʻagaoioia koluma vili C18 i le tolu fufulu o le 0.1% formic acid (FA) i le acetonitrile (AcN) (Merck) ma le lua fufulu ole 0.1% FA.Sa fa'asusu le koluma ile 0.1% FA mo le 15 minute.U'u fa'ata'ita'iga i koluma vili ma fufulu fa'atolu ile 0.1% FA.O peptide fa'amama sa fa'asolosolo fa'asolosolo fa'atasi ma se fa'asolosolo fa'asolosolo e fa'aaoga ai le 50%, 80% ma le 100% AcN i le 0.1% FA.O fa'ata'ita'iga na fa'amago i totonu o le SpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) se'ia mou atu atoa le vai totoe.O peptides eluted na faʻamavaeina i le 100 μl o le 0.08% trifluoroacetic acid i le 2.5% AcN ma le faʻatonuga na fuaina i luga ole NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).E tusa ma le 1 μg o le peptide faʻafesoʻotaʻi i le faʻataʻitaʻiga na tui i totonu o le LC-MS / MS system.
O peptide feso'ota'i fa'alava na tu'u'ese'ese ile faiga ole UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) fa'afeso'ota'i ile Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).O peptide feso'ota'i fa'alava na aoina i luga ole 300 µm ID, 5 mm le umi µ-mua'i-koluma C18 pu'eina koluma fa'apipi'i ile C18 PepMap100 sorbent ma le 5 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).U'u le pamu ua seti i le 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid ua solo i le 2.5% AcN.O peptide feso'ota'i fa'alava na tu'u'ese'ese i luga o se koluma silica fused analytical ma lona lautele totonu o le 75 μm ma le umi o le 150 mm, fa'atumu i le 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).O vaega feavea'i A ma le B e aofia ai le 0.1% FA i le vai ma le 0.1% FA i le acetonitrile.O le fa'alili e amata i le 2.5% B ma fa'atupula'ia laina i le 40% B ile 90 minute, ona o'o lea ile 90% B ile isi 2 minute.O le tuufaatasiga o vaega feaveaʻi na tausia ile 90% B mo le 10 minute ona faʻaititia ai lea ile 2.5% B ile 2 minute.O le koluma na fa'atutusa i le 2.5% B mo le 8 minute a'o le'i faia le isi taamilosaga.O peptide feso'ota'i fa'alava na fa'asa'oloto mai le koluma su'esu'e sa fa'a'ona i totonu o le nanoelectrospray ionization (NSI) puna ma tui i totonu o le Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
O le Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer o loʻo faʻaogaina i le faʻaogaina o faʻamaumauga lelei.Na faia se su'esu'ega atoa i le vaega fa'atusa i se iugafono o le 120,000 fa'atasi ai ma fa'asologa o laina mai le m/z 350 Th i le m/z 2000 Th.Ole fa'atonuga ole AGC na fa'atulaga ile 300% fa'atasi ai ma le maualuga ole taimi fa'aoga ole 50ms.Monoisotopic peak detection ua faʻamautuina mo peptides.O le fa'agata fa'anofoaga fa'agata e fa'atu i le sa'o pe a na'o le tele o mea muamua e maua.O le la'ititi o le malosi o le ionic o le mea muamua na seti i le 5.0e3 ma o le tau muamua e o'o atu i le +8 na aofia ai i su'ega.
O le ta'amilosaga i le va o su'esu'ega tetele i le fa'asologa o fa'amaumauga sa fa'atulaga ile 2.5 sekone.Dynamic mass tuusaunoaga na seti i le 20 s ina ua uma le vaevaega muamua o le ion muamua.O le faʻamalama faʻaesea muamua na seti i le 2 Th.O le ituaiga o le malosi faʻafefeteina faʻatasi ma le faʻaogaina o le malosi o le faʻalavelave faʻafuaseʻi na filifilia i se suʻesuʻega MS/MS faʻalagolago i faʻamatalaga.Malosi fa'alavelave fa'atulaga ile 30%.O le iugafono a le Orbitrap na faʻatulagaina i le 15,000 ma le AGC faʻamoemoe i le 100%.Ole taimi ole tui ole aganu'u ua seti ile 60 milliseconds.
Aʻo leʻi suʻesuʻeina le fesoʻotaʻiga protein-protein i faʻataʻitaʻiga fesoʻotaʻi, matou te faʻaogaina faila mataʻutia e faʻaaoga ai le MaxQuant package (version 1.6.12.0)26,27 e iloa ai peptides / porotini e mafai ona suʻeina i faʻataʻitaʻiga.E le gata i lea, o suʻesuʻega proteomic tutusa na faia i luga o faʻataʻitaʻiga Flo-1 e leʻi faʻasalalauina na togafitia ma le togafitia i le IFNα.Sa su'esu'eina fa'amaumauga MS/MS i le UniProt human database (www.uniprot.org) (uploaded August 12, 2020, e aofia ai 75,093 entry) e fa'aaoga ai le masini su'esu'e fau-i totonu Andromeda27.O le sailiga na faia e aunoa ma le faʻaalia o le faʻapitoa o le enzyme ma suiga eseese o le deamidation (N, Q) ma le faʻamaʻiina (M).O fa'apalepale fa'amuamua na fa'atulaga i le 20 ppm ma fa'aputu oloa i le 0.02 Da.O le muamua ma le maualuga o le eseesega o le tele na seti i le 10 ppm.O le maualuga maualuga o le peptide na seti i le 4600 Da ma o le faasologa tutusa na seti i le va o le 7 ma le 25 amino acids (aa).O isi su'esu'ega fa'afuainumera na fa'atino e fa'aaoga ai le polokalame Perseus (version 1.6.10.45).O mea e maua i le polotini na fuafuaina e ala i le faʻavasegaina o le malosi o le polotini (LFQ malosi; faʻavasegaina le faʻailoga)27 ma faʻaliliuina le malosi i le Log2.O se fa'aputugā fa'avasegaina o polotini na fa'ailoa mai e lo latou malosi peptide na fausia i le fa'aogaina o le pheatmap (v1.0.12) afifi i le R (v 4.1.2).Sa faia le suʻesuʻega o le faʻatamaoaigaina o auala e faʻaaoga ai le Reactome pathway database mo IFNα-treated proteins e sili atu ma le fa taimi faʻaagaoioia pe a faʻatusatusa i faʻataʻitaʻiga e leʻi togafitia.
Fa'ailoaina o le lysine (K) po'o le serine (S) fa'afeso'ota'i fa'akomepiuta fa'apitoa o palatini fa'alavelave mata'ituina e le LC-MS/MS na fa'atinoina i le fa'aaogaina o se masini fa'ailoa fa'apitoa (SIM-XL) mo peptide feso'ota'i (SIM-XL)29.Muamua, o fegalegaleaiga e mafai i le va o le interferon-sociated (IFN) DNA damage resistance saini (IRDS) na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le IRDS protein dataset o loʻo faʻamatalaina i Padariya et al.28.O le su'esu'eina o tulaga uma ma toe faia o le tagata UniProt atoa e malosi tele, o le mea lea o le tagata UniProt database atoa (www.uniprot.org) (sii mai i le aso 12 Aokuso 2020, o lo'o i ai 75,093 fa'amaumauga) fa'asaga IFNα-togafitiga toe fai.O se tasi o filiga mo fegalegaleaiga maualuga faatuatuaina.O nei fesoʻotaʻiga maualuga-taua na maua na faʻalauteleina ma faʻataʻitaʻiina i toe fai uma ma tulaga.
I le SIM-XL, na faʻaaogaina le DSS mo le fesoʻotaʻiga (XL) ma le suiga o le mamafa XL ma le suiga o le mamafa na faʻatulagaina i le 138.06 ma le 156.07, i le faasologa.O nofoaga fa'afeso'ota'i o lo'o ta'ua i lalo e fa'atatauina: KK, KS ma le KN-TERM, e aunoa ma ni iona fa'asalalau.O le mua'i ma le fragment ppm na fa'atulaga i le 20 ma le Xrea threshold na seti i le 0.15.Trypsin na manatu e matua faʻapitoa, ma sa faʻatinoina se auala faʻapipiʻi maualuga C-trap (HCD).O le XCorr dynamic DB reduction threshold ma le numera aupito maualalo o peptides mo le faʻaitiitia o le DB faʻamalosi na seti i le 2.5 ma le 2, i le faasologa.O isi ta'otoga o le: monoisotope probability ma le tumutumuga fa'afuase'i tipi tipi, la'ititi 4 AA toega i le manoa ma le maualuga o le tau o le manoa, ma le 3 maxima o le misia vaeluaga.O fa'afanua 2D fa'ai'uga na su'iina sa su'esu'eina ile (SIM-XL) ma sa fa'aogaina le ata fa'atusa o le xQuest28 e fausia ai fa'afanua 2D.O fesoʻotaʻiga o porotini i luga o fausaga polotini o loʻo tuʻuina atu ile PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
O fausaga faʻataʻitaʻiga o le protein na faia e faʻaaoga ai le Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 11 faʻaaogaina mataupu faavae o le faʻataʻitaʻiga o le homology ma le faʻatinoina o le "Metotia Markov Natia".O le Phyre2 e fa'atupuina fa'ata'ita'iga fa'avae e fa'atatau i fa'asologa fa'asologa ma fa'apolotini iloa.Mo H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ma MDN1 polotini, fausaga mamanu 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ma le 6i2665 sa faʻaaogaina.E le gata i lea, o le fausaga o AlphaFold71 MX1, UBP18 ma ROBO1 sa iloiloina foi.O le fausaga o le protein na faʻaalia i le faʻaaogaina o le BIOVIA Discovery Studio Visualizer package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, ISA) ma le Molecular Operating Environment package (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanata).