ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Mo vaega vailaʻau faʻainisinia, le lava o le SPECC1L e oʻo atu ai i le faʻateleina o le mautu o sooga faʻapipiʻi ma faʻaitiitia le faʻamaligiina o sela o le neural crest cranial.

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ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Uelese Tube Mo Alamanuia Kemisi

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.o se ta'uta'ua gaosi oloa e fa'apitoa i paipa fa'alilolilo u'amea u'amea, paipa fa'afefete fa'afefete, fa'a'au fa'a'au'au fa'alava ma isi.Ina ia faafaigofieina tagata faatau, ua matou ueloina paipa ma paipa foi.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.o loʻo i ai le gaosiga sili ona maualuga ma faʻataʻitaʻiga meafaigaluega.E mafai ona matou faamalieina atoatoa lou manaʻoga.E tusa ai ma tulaga faʻapitoa, o paipa e gaosia e matou e masani lava ona saʻo le OD ma le WT faʻapalepale.O le fa'apalepale pulea e matua'i fa'atatau ile tu'uina atu o tulaga fa'ata'atia.O a matou oloa e faʻamalieina i taimi uma i tagata faʻatau.Na fa'atau e tagata fa'atau a tatou oloa na maua ai le tele o tupe mama.
a) OD (Outer Diameter): 3.18mm i le 101.6mm
e) WT (Pale Mafiafia): 0.5mm i le 20mm
c) Umi: E tusa ai ma manaoga o tagata faatau
d) Tulaga Fa'atonu : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ma isi
u) Metotia Fa'agasologa : ERW, EFW ma isi

Fa'ase'e o lo'o fa'aalia tala e tolu ile fa'ata.Fa'aoga le pito i tua ma le isi ki e fa'asolo ai fa'ase'e, po'o fa'amau fa'ase'e i le pito e fa'asolo ai fa'ase'e ta'itasi.
O sela o neural crest cranial (CNCC) e toso ese mai le gaugau neural embryonic ma alu atu i le fa'aofuofu pharyngeal, lea e fausia ai le tele o fausaga ogatotonu.O le fa'aletonu o le CNCC e iai sona sao taua i le mafua'aga o le fa'ama'i o le fa'ama'i, o se fa'aletonu masani fa'anatinati.O suiga o le SPECC1L Heterozygous ua maua i tagata mama'i ma'i ma'i ma'i.O iinei, matou te lipotia le faʻaleleia atili o le faʻaogaina o vaega faʻapipiʻi faʻapipiʻi (AJ), β-catenin ma le E-cadherin i sela tuʻituʻi SPECC1L faʻaleaganuʻu, ma faʻataʻitaʻiga eletise eletise o loʻo faʻaalia ai le faʻasalalauga apical-basal o le AJ.Ina ia malamalama i le matafaioi a le SPECC1L i le craniofacial morphogenesis, na matou fatuina se faʻataʻitaʻiga ole kiore Specc1l.O mutants Homozygous e fa'ato'a oti ma fa'aalia ai le fa'aletonu o le tapuni neural tube ma le CNCC lamination.AJ polotini staining ua faateleina i gauga neural mutant.O lenei faaletonu AJ e ogatasi ma se faaletonu i le CNCC delamination, e manaʻomia ai le faʻamavaeina o le AJ.E le gata i lea, o le Specc11 mutants ua faʻaititia le PI3K-AKT faʻailoga ma faʻateleina apoptosis.In vitro, o le faʻafefe malie o le PI3K-AKT faʻailoga i totonu o sela vao na lava e faʻaosofia ai suiga AJ.O le mea taua, o suiga a le AJ e fa'aosoina e le SPECC1L knockdown e mafai ona toe fa'afo'i e ala i le fa'agaoioia o le ala PI3K-AKT.I le tuʻufaʻatasia, o nei faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o le SPECC1L, o se faʻatonuga o le PI3K-AKT faʻailoga ma le AJ biology, e manaʻomia mo le tapunia o le neural tube ma le CNCC stratification.
O sela o le neural crest cranial (CNCCs) o loʻo faʻaogaina i le neuroectoderm dorsal ma vavae ese mai le neuroepithelium o le atinaʻeina o gaugau neural e ala i se gaioiga e aofia ai le epithelial-mesenchymal transition (EMT)1,2,3.O le epithelial CNCCs muamua e fa'alavelaveina feso'ota'iga va'ava'ai ma avea ma CNCC mesenchymal femalaga'i e fa'atumu ai le fa'aofuofu muamua ma le lona lua o le pharyngeal ma fausia ai le tele o le cartilage craniofacial.O le mea lea, o kenera e faʻatonutonu ai galuega a le CNCC e masani ona faʻalavelaveina i le mafuaʻaga o faʻalavelave faʻafuaseʻi o le craniofacial e pei o faʻamaʻi faʻamaʻi, e masani ona aʻafia ai le 1/800 fanau mai i le US lava ia.O se tasi o faaletonu o le fanau mai8.
O le faʻamalamalamaina o le CNCC e fetaui lelei ma le tapunia o le faʻauʻu neural pito i luma i le va o 8.5 ma 9.5 aso o le atinaʻeina o le embryonic i isumu.O mutants o le tele o kenera e feso'ota'i i le isumu po'o fa'a-facial cleft e fa'aalia ai fo'i nisi ituaiga o fa'aletonu o le neural tube, e aofia ai Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ma Pdgfrα12.Ae ui i lea, o faʻagasologa o le tapunia o le neural tube ma le CNCC stratification e mafai ona manatu tutoʻatasi, e pei o le Splotch mutant mouse (Pax3) o loʻo faʻaalia ni faaletonu i le tapunia o le neural tube e aunoa ma se aafiaga ile CNCC stratification poʻo le femalagaiga 13,14.O fa'ata'ita'iga fa'aopoopo o isumu ma fa'aletonu i le fa'a'ese'esega o le CNCC ma le tapuni neural tube o le a fesoasoani e fa'ata'atia le fa'avae mole masani o nei faiga e lua.
O le vavaeeseina o le CNCC mai sela neuroepithelial e manaʻomia ai le faʻamavaeina o fesoʻotaʻiga faʻapipiʻi (AJs), lea e aofia ai faʻalavelave faʻapolotini o loʻo i ai, faatasi ai ma isi, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ma le α-actinin e fesoʻotaʻi ma filaments actin 2 O suʻesuʻega faʻamatalaga E-cadherin i neural folds na faʻaalia ai le faʻaitiitia poʻo le tuai i le CNCC delamination.I le isi itu, o le taofiofia o le E-cadherin e mafua ai le stratification vave15,16.O le tele o mea taua e faʻafesoʻotaʻi ai le EMT i le taimi o le CNCC stratification o faʻamaumauga (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ma extracellular matrix (ECM) toe faʻaleleia polotini e pei o matrix metalloproteinases (MMPs), peitaʻi o CNCCs o le cytoskeletal AJ regulators saʻo. e lei iloa.O le ala PI3K-AKT ua iloa e fa'afete'ena'i le maualuga o le E-cadherin, aemaise lava mai su'esu'ega o le kanesa17.O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia ai o le leiloa o le PDGFα-faʻavae PI3K-AKT faʻailoga i isumu e oʻo atu ai i faʻalavelave faʻaleagaina, e aofia ai le gaogao palate ma neural tube defects12.Ae ui i lea, o le sootaga i le va o le PI3K-AKT ala ma le AJ mautu i luga o le CNCC stratification e le o manino.
Na matou faailoaina muamua le SPECC1L o le muamua mutant gene i ni tagata se toʻalua e matuaʻi tuga e alu atu mai le gutu i le mata, e taʻua o le oblique cleft (ObFC) poʻo Tessier IV18 cleft.O suiga o le SPECC1L ua fa'ailoaina i totonu o aiga e lua fa'atuputupula'ia fa'atasi ai ma le autosomal dominant Opitz G/BBB syndrome (OMIM #145410), lea na fa'aalia ai e tagata ta'ito'atasi le va'ai mamao ma laugutu laugutu19, ma i totonu o le aiga e tasi e maua i Tibi overdistance syndrome (OMIM #145420)20 .e sili atu ma le afa o mataupu o le Opitz G / BBB syndrome e fesoʻotaʻi-X (OMIM #300000) ma e mafua mai i suiga i le MID1 gene, lea e faʻaogaina ai le protein 22 o le microtubule-associated cell skeleton.Matou te manatu o le SPECC1L, o se porotini foi e fesoʻotaʻi ma microtubules ma le actin cytoskeleton, e mafai ona faʻatalanoaina faʻailoga e manaʻomia mo le toe faʻaleleia o le cytoskeleton actin i le taimi o le pipii o le sela ma le femalagaiga 18.E ala i suʻesuʻega in vitro ma in vivo, matou te faʻamatalaina nei le SPECC1L o se faʻatonuga o le AJ mautu e ala i le PI3K-AKT faʻailoga.I luga o le telefoni feaveaʻi, o le SPECC1L deficiency na mafua ai le faʻaitiitia o le maualuga o le pan-AKT protein ma le faʻateleina o le faʻasalalau apical-basal o le AJ, lea na faʻaumatia e ala i le faʻaogaina o vailaʻau o le ala AKT.I vivo, Specc11-deficient embryos o loʻo faʻaalia ai le faaletonu o le tapuni neural tube ma faʻaititia le CNCC dissection.Ole mea lea, ole SPECC1L o lo'o galue ile fa'atulafonoina fa'apipi'i fa'amaufa'ailoga e mana'omia mo galuega masani a le CNCC i le taimi o le fa'aogaina o foliga.
Ina ia faʻaalia le matafaioi a le SPECC1L i le telefoni feaveaʻi, matou te faʻaogaina le laina ole osteosarcoma faʻamautu o loʻo faʻamatalaina muamua i le SPECC1L18.O nei sela U2OS mautu ma SPECC1L (kd) knockdown sa i ai se faʻaititia (60-70%) i le maualuga o SPECC1L transcripts ma proteins, faʻatasi ai ma faʻaletonu i femalagaiga ma le toe faʻatulagaina o le actin cytoskeleton 18. SPECC1L ua faʻaalia e taʻitaʻia ai faʻaletonu mitotic 23 .I luga o isi faʻamatalaga, na matou iloa ai o matou SPECC1L-kd sela mautu na suia le morphology i se maualuga maualuga o le faʻafeiloaʻiga (Ata 1).O sela faʻatonutonu taʻitoʻatasi ma sela kd i faʻatasiga maualalo e foliga tutusa (Ata 1A,D).24 itula talu ona maeʻa le tuʻufaʻatasia, na faʻatumauina ai e sela e pulea o latou foliga faʻapipiʻi (Ata 1B, E), aʻo faʻalauteleina sela SPECC1L-kd (Ata 1C, F).O le tele o lenei suiga i foliga o le sela na puʻeina e in vivo faʻataʻitaʻiga ola o sela pulea ma sela kd (tiea 1).Ina ia iloa le matafaioi a le SPECC1L i sela faʻatasi, matou te suʻesuʻeina muamua lona faʻaaliga.Na matou iloa o le SPECC1L protein maualuga maualuga i luga o le fusi (Ata 1G), ae o le SPECC1L transcript maualuga e leʻi faʻateleina (Ata 1H).E le gata i lea, aʻo faʻateleina le tele o le cell, ua faʻaputuina le protein SPECC1L i tuaoi intercellular (Fig. 2A-E), faʻatasi ai ma se mamanu faʻapipiʻi ma le β-catenin e fesoʻotaʻi i le membrane (Fig. 2A'-E').Tuuina atu le fesoʻotaʻiga a SPECC1L ma le actin cytoskeleton 18,23 matou te faʻapea o le SPECC1L e fegalegaleai ma faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻavae (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) sela e faaumiumi i le maualuga o le fefiloi (F) pe a faatusatusa i le pulea o sela U2OS (AC).O lo'o fa'aalia iinei o le tolu o taimi e ono (T1, T3, T6) na matou filifilia mo le tele o sela eseese.(G) Western blot analysis o loʻo faʻaalia ai o le SPECC1L protein o loʻo faʻamautu i se maualuga maualuga o le faʻafeiloaʻiga pe a faʻatusatusa i le maualalo o le faʻafefe i totonu o sela pulea.Western blot o SPECC1L o lo'o fa'aalia ai le 120 kDa fa'amoemoeina ma se pa'u mamafa mole mole maualuga, atonu e toe fa'aliliuina (*).Western blot analysis na faia i lalo o tulaga tutusa mo le maualalo ma le maualuga o le faʻafeiloaʻiga.O ata o lo'o fa'aalia ai le SPECC1L ile va'aiga maualalo ma le maualuga na ave mai ile poloka lava e tasi.Ole poloka lava lea e tasi na aveese ma toe suʻesuʻeina ile β-actin antibody.(H) Ole su'esu'ega ole RT-PCR ole tele na fa'aalia ai le leai o ni suiga taua ile SPECC1L transcript levels.Fa'ailoga sese e fai ma sui o SEM mai fa'ata'ita'iga tuto'atasi e fa.
(AE) Na matou filifilia ni taimi e ono (T1-T6) e fai ma sui o le tele o le tele o sela e faʻavasega ai suʻesuʻega foliga ma suiga AJ i sela U2OS ma SPECC1L knockdown (kd).O le lima muamua o nei taimi taimi e aofia ai sela taʻitasi (T1), 50-70% fusuaga o fuifui sela laiti (T2), fusi e aunoa ma le toe faʻafouina o sela kd (T3), toe faʻafouina sela kd (T4), ma suiga 24 itula.i le pito i tua o sela kd (T5).O le polotini SPECC1L na tele ina salalau i le cytoplasm i le T1 (A), ae o lona faʻaputuina na matauina i tuaoi intercellular i taimi mulimuli ane (B-E, aū).(FJ) β-catenin o loʻo faʻaalia le faʻaputuina tutusa i tuaoi intercellular e fesoʻotaʻi ma le faʻalavelave AJ.(A'-E') SPECC1L ma le β-catenin o lo'o fa'aalia ai le fa'afefeteina o le pisia i tua'oi o le sela i le maualuga o le cell density (aū).(F'-J') I sela SPECC1L-kd, o le pisia o le β-catenin e foliga masani i le maualalo o le tele o sela (F'-H'), ae faʻalauteleina pe a suia foliga o sela (I', J'; aū), e faʻaalia ai le AJ. ua suia.Pa = 10 µm.
Ona matou taumafai lea e fuafua le aʻafiaga o le faaletonu o le SPECC1L ile AJ.Na matou faʻaogaina le tele o faʻailoga e fesoʻotaʻi ma le AJ, e aofia ai vaega faʻapitoa F-actin, myosin IIb, β-catenin, ma E-cadherin24,25,26,27.Actin stress fiber ua faateleina i sela SPECC1L-kd e pei ona faamatalaina muamua (Fig. 3A,B) 18.Myosin IIb e fesoʻotaʻi ma filaments actin na faʻaalia ai se faʻaopoopoga tutusa i sela SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).O le β-catenin e fesoʻotaʻi ma le AJ e fusifusia i le cadherin i le membrane cell, e faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga masani o le "honeycomb" i le pulea o cubocytes (Fig 3E, G).O le mea e mataʻina ai, i ata mafolafola e faʻaaoga ai microscopy confocal, β-catenin (Fig. 3E, F) ma le E-cadherin (Fig. 3G, H) o loʻo faʻapipiʻiina i luga o le sela sela o le faʻaogaina o le SPECC1L-deficient sela na faʻaalia ai mamanu iloga o le faʻalauteleina o le pisia.O lenei faʻalauteleina o le β-catenin staining e fesoʻotaʻi ma le AJ i sela kd na sili ona faʻaalia i le faʻafeiloaʻiga, ae foliga mai e muamua atu i suiga i foliga o le sela (Fig. 2F-J, F'-J').Ina ia iloa le natura faaletino o lenei faʻalauteleina AJ staining, na matou suʻesuʻeina tuaoi o sela i luga o le apical-basal surface o SPECC1L-kd U2OS sela e ala i le faʻaogaina o le microscopy electron (TEM) (Ata 3I, J).I le faatusatusa atu i sela pulea (Fig. 3I), lea sa i ai vaega eseese electron mafiafia faʻaalia o le AJ (aū), kd sela (Fig. 3J) na faʻaalia ai le tele, faʻafesoʻotaʻi itulagi o maualuga eletise eletise faʻaalia o le AJ i luga o le vaalele apicobasal..E le gata i lea, i luga o vaega felafolafoaʻi, na matou matauina ai le tele o gaugau sela sela i sela kd (Fig. S1A, B), lea e faʻamatalaina ai le faʻalauteleina o le mamanu o fusi β-catenin ma E-cadherin (Fig. 3F, H).I le lagolagoina o le matafaioi a le SPECC1L i AJs, β-catenin na faʻapipiʻiina faʻatasi ma SPECC1L i lysates o sela U2OS faʻatasi (Fig. 3K).Faatasi ai ma le faʻalauteleina o le immunostaining mo faʻailoga AJ, o suʻesuʻega TEM na ogatasi ma lo matou manatu o le faaletonu o le SPECC1L e faʻateleina ai le maualuga ma le eseesega o le AJ apical-basal.
(AH) Faʻateleina F-actin staining i sela kd i le 48 itula pe a maeʻa le fusi (T6; A, B).Suia le pisia o le myosin IIb e fesoʻotaʻi ma F-actin (C, D).O le mamanu lamolemole o le β-catenin ma le E-cadherin membrane staining i sela pulea (E, G) na faʻaleleia i sela SPECC1L-kd (F, H).Pa = 10 µm.(I-J) Electron micrographs o loʻo matauina le apical-basal intercellular junction.O sela fa'atonutonu e fa'aalia ai vaega fa'aeletonika ma'oti e fa'ailoa ai feso'ota'iga pipii (I, aū).I se eseesega, o le apical-basal junction atoa i sela SPECC1L-kd na foliga mai o le eletise eletise (J, aū), e faʻaalia ai le faʻateleina o le mamafa ma le faʻasalalauina o fesoʻotaʻiga pipii.(K) β-catenin sa faʻatasi-immunoprecipitated ma SPECC1L i faʻatasi U2OS cell lysates.Ata na pu'eina mai le tasi nofoaga e fai ma sui o se tasi o fa'ata'ita'iga tuto'atasi e fa.
Ina ia malamalama i le matafaioi a le SPECC1L i le craniofacial morphogenesis, na matou faia ai se faʻataʻitaʻiga o le kiore Specc1l e faʻaaoga ai laina tutoʻatasi ES trap cell, DTM096 ma RRH048 (BayGenomics, CA), lea e fai ma sui o le intron 1 ma Specc1l transcripts na puʻeina i le 15 (Fig. 1) .4A, ata S2).O le nofoaga o le genomic o le mea faʻapipiʻi faʻailoga faʻapipiʻi na fuafuaina i le faʻasologa atoa o le genome ma faʻamaonia e le PCR (Fig. S2).O mamanu mailei uma e lua na mafai ai foi ona tuʻufaʻatasia i totonu o le faʻasalalauga a le au tusitala Specc11-lacZ pe a puʻeina.O le mea lea, lacZ faʻamatalaga fuafuaina e X-gal staining na faʻaaogaina e fai ma faʻaaliga o le Specc11 faʻamatalaga.O mea uma e lua na faʻaalia foliga tutusa lacZ, faʻatasi ai ma le mailei o le DTM096 i le intron 1 o loʻo faʻaalia ai le malosi atu nai lo le RRH048 i le intron 15 (e le o faʻaalia).Ae ui i lea, Specc1l o loʻo faʻaalia lautele, faʻatasi ai ma faʻamatalaga malosi i totonu o gaugau neural i le E8.5 (Ata 4B), i totonu o le neural tube ma foliga i le E9.5 ma le E10.5 (Ata 4C, D), ma le atinaʻeina o vae. i le E10.5 ma mata (Ata 4D).Na matou lipotia muamua o le SPECC1L faʻamatalaga i le faʻailoga muamua o le pharyngeal i le E10.5 sa i ai i le epithelium ma lalo ifo o le mesenchyme18, e ogatasi ma le gafa CNCC.Ina ia faʻataʻitaʻiina le SPECC1L faʻamatalaga i le CNCC, matou te faia le E8.5 neural folds (Ata 4E-J) ma le E9.5 vaega ulupulu (Ata 4K-).I le E8.5, SPECC1L pisia neural gaugau malosi (Fig. 4E, H), e aofia ai sela pisia i faailoga NCC (Fig. 4G, J).I le E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) malosi faʻafefeteina femalagaaʻi CNCC faʻatasi ma AP2A (Fig. 4L, M) poʻo SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o le kenera Specc11 o le isumu o lo'o fa'aalia ai le fa'aofiina o vete fa'akomepiuta ile ES DTM096 (intron 1) ma RRH048 (intron 15) cell clones.(BD) lacZ staining o heterozygous Specc1lDTM096 embryos fa'atusa Specc1l fa'aaliga mai le E8.5 i le E10.5.NE = neuroectoderm, NF = gauga neural, PA1 = fa'agogo muamua o le pharyngeal.(EP) SPECC1L immunostaining ma NCC maka AP2A ma SOX10 i E8.5 (NF; EJ) gaugau neural ma E9.5 (KP) vaega ulupoʻo.SPECC1L staining sa masani ona matauina i neural gauga E8.5 (E, H; arrowheads), e aofia ai sela ua faailogaina i AP2A (F, G; arrowheads) ma SOX10 (I, J; arrowheads).I le E9.5, SPECC1L malosi fa'ailoga CNCCs (K, N; aū) fa'ailoga AP2A (L, M; aū) ma SOX10 (O, P; aū).
O le sopoia i le va o le heterozygous Specc1lDTM096/+ ma Specc1lRRH048/+ isumu e iloa ai e lua mailei mailei e le tutusa ma o le heterozygotes faʻapipiʻi ma embryonic homozygotes mo soʻo se tasi o mailei mailei e faʻamaʻi oti (Laulau S1).Mendelian ratios na faʻaalia ai le faʻaitiitia o le ola o le heterozygotes i le fanau mai (faʻamoemoeina 1.34 vs. 2.0).Na matou matauina le maualalo o le oti i le va o heterozygotes, o nisi na i ai ni faaletonu o le craniofacial (Fig. S3).Ae ui i lea, o le maualalo o le faʻaogaina o nei faʻataʻitaʻiga o le craniofacial phenotypes e faigata ai ona suʻesuʻeina a latou faiga faʻavae pathophysiological.O le mea lea, na matou taulaʻi atu i le faʻamaʻi faʻamaʻi faʻamaʻi o le homozygous Specc11 mutants.
O le tele o le heterozygous poʻo le homozygous Specc1lDTM096/RRH048 mutant embryos e leʻi tupu pe a uma le E9.5-10.5 (Fig. 5A-D), ma o le neural tube e leʻi tapunia i luma (Fig. 5B, D) ma o nisi taimi e tapunia i tua (e le o faʻaalia) ..O lenei faaletonu o le tapuni neural tube na fesoʻotaʻi ma le tele o le CNCC faʻailoga DLX2 o loʻo totoe i totonu ole gauga neural ile E10.5, e faʻaalia ai le leai o se faʻamaʻi (Ata 5A'-D').Ina ia iloa pe na faʻaititia foʻi le aofaʻi atoa o le CNCC, na matou faʻailoga laina CNCC ma le GFP i la matou laina mailei faʻatasi ma Wnt1-Cre ma ROSAmTmG.Matou te fa'avasegaina le GFP+ NCC ma le GFP- (RFP+) e le o le NCC mai afuafua uma.I le E9.5, o le faʻasologa o faʻasologa o le GFP-faʻailoga CNCCs e leʻi suia tele i le va o le WT ma le mutant embryos (e le o faʻaalia), e faʻaalia ai faʻamatalaga masani CNCC.O le mea lea, na matou manatu ai o totoe Wnt1-Cre ma DLX2 staining i gauga neural faʻaalia (Ata 5B ') na mafua ona o le faaletonu o le CNCC layering, masalo ona o le faateleina o le mamafa poʻo le faʻasalalauina o sela AJ, e pei ona vaʻaia i sela SPECC1L-kd.Na matou faʻaogaina le NCC faʻailoga SOX10, AP2A, ma le DLX2 e faʻamaonia ai le i ai o le CNCC i le neural fold (Ata 5E-R).I le E8.5, na vaʻaia ai le gaugau neural mo faʻailoga uma e tolu o le NCC i vaega o le WT (Fig. 5E, G, I) ma le Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).I le E9.5, a'o fa'ailoga NCC fa'ailoga NCC femalaga'iga i vaega WT (Fig. 5M, O, Q), o totoe NCC staining sa matauina i gauga neural fa'aalia o Specc1l mutant embryos (Fig. 5N, P, R).Talu ai ona o le SOX10 ma le DLX2 o lo'o fa'ailoga CNCC o lo'o faimalaga, o lenei fa'ai'uga e ta'u mai ai o le SPECC1L-le atoatoa le CNCC e ausia le fa'amatalaga pe a mae'a femalaga'iga ae le mafai ona alu ese mai neural folds.
O le faaletonu o le Specc11 e taitai atu ai i le faaletonu o le faagaau neural tapuni, delamination o sela neural crest cranial ma AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo o lo'o feavea'i sela o neural crest (CNCC) ua fa'ailogaina i le Wnt1-Cre (A').I se fa'afeagai, Specc11 mutant embryos o lo'o fa'aalia ni gaugau neural matala (B), ulu aū) ma CNCC e le'i malaga mai (B', ulu aū).(C, D') Ata susulu fanua (C, D') ma immunostaining (C', D') o le CNCC maka DLX2 o E10.5 WT embryos (C, C') ma Specc1l (D, D').I le WT E10.5 embryos, DLX2-positive CNCC colonize gill arches (C', arrows), ae i mutants, o loʻo faʻaauau pea le pisia mataʻutia i totonu o gaugau neural matala (D', arrow) ma i totonu o faʻailoga muamua o pharyngeal (D', aū).) faʻatasi ai ma ni faʻailoga (aū) e faʻaalia ai le leaga o le delamination ma le femalagaiga o CNCC.ER) O vaega o WT ma Specc1l mutant embryos i laʻasaga E8.5 (E-L) ma E9.5 (M-R) na faʻailogaina i faʻailoga NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ma le DLX2 (I, J, Q, R).I le E8.5, o le NCC staining na matauina i le vao-type neural fold (NF) ma vaega mutant.O le faʻapipiʻiina o le SOX10 ma le β-catenin i le E8.5 WT (K) ma le mutant (L) na faʻaalia ai le faʻateleina o le β-catenin staining i tuaoi o le cell i totonu o gauga neural.I le E9.5, o le vao-ituaiga staining o migrating CNCCs (M, O, Q) na matauina, ae i mutants, unstratified CNCCs pisipisia tatala neural gaugau (N, P, R).(S–Z) I vivo AJ su'esu'ega fa'ailoga i vaega o le korona o WT ma Specc11DTM096/RRH048 embryos ma le E9.5 mutation.O lo'o fa'aalia se va'alele fa'atatau ile pito i luga taumatau.I vaega o le mutant tissues, na matauina le faateleina o le pisia o F-actin (S, T) ma myosin IIb (U, V).E tutusa ma le in vitro iʻuga i le Ata 3, i le mutant embryos, faʻaleleia le staining membrane mo β-catenin (W, X) ma E-cadherin (Y, Z) na matauina.(AA-BB) O se micrograph electron o se vaega o le vao-ituaiga embryo e tilotilo i tua atu o le tuaoi o le apical-basal cell o loʻo faʻaalia ai se vaega eletonika maʻoti e faʻaalia ai fesoʻotaʻiga pipii (AA, aū).I le eseesega, i vaega o Specc11 mutant embryos (BB, arrow), o le apicobasal junction atoa o le eletise eletise, e faʻaalia ai le faʻateleina o le mamafa ma le faʻasalalauina o fesoʻotaʻiga pipii.
Ina ia fa'ata'ita'i lo matou manatu e fa'apea o le fa'aitiitia o le fa'afugaga e mafua mai i le suiga o le AJ, na matou su'esu'eina le fa'ailoga AJ i gauga neural fa'aalia o Specc1l mutant embryos (Fig. 5S-Z).Na matou matauina le faʻateleina o filo faʻamalosi o le actin (Fig. 5S, T) ma le faʻateleina o le faʻaogaina o le myosin IIB staining i luga o alava actin (Fig. 5U, V).O le mea taua, na matou matauina le faateleina o le pisia o le β-catenin (Fig. 5W, X) ma le E-cadherin (Fig. 5Y, Z) i tuaoi intercellular.Na matou suʻesuʻeina foʻi le β-catenin staining o le NCC i le neural gauga o E8.5 embryos (Fig. 5K, L).O le β-catenin staining na foliga mai e sili atu le malosi i Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L ma K), faʻailoa mai ua amata suiga AJ.I micrographs electron o vaega ulupulu o E9.5 embryos, na matou toe matauina le faateleina o le staining electron-dense diffuse i Specc1l mutant embryos pe a faatusatusa i le WT (Fig. 5AA, BB ma S1E-H).A tu'ufa'atasia, o nei fa'ai'uga e lagolagoina ai a tatou fa'ai'uga in vitro i sela SPECC1L-kd U2OS ma fa'ailoa mai o le staining AJ aberrant e muamua atu i le stratification CNCC i a tatou mutant embryos.
Tuuina atu le fesoʻotaʻiga vavalalata i le va o le AKT ma le E-cadherin mautu, 17,28 matou te faʻamaonia le aʻafia o le PI3K-AKT faʻailoga.E le gata i lea, na matou matauina le faʻafefe o le subepidermal i nisi o a matou mutant embryos na sao mai le faʻamaʻi (<5%) i le E9.5-10.5 ae faʻamautu i le E13.5 (Fig. S3).Subepidermal vesicle o se faʻailoga o le faʻaitiitia o le faʻailoga PI3K-AKT faʻavae i luga o le PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) lipotia mai o le faʻalavelaveina o le faʻaogaina o le PI3K faʻavae PDGFRα i le PdgfraPI3K / PI3K mutant embryos e mafua ai vesicles subepidermal, faʻaletonu o le neural tube, ma faʻamaʻi palate phenotypes.O le mea moni, o le maualuga o le pan-AKT ma le phosphorylated Ser473-AKT malosi na faʻaititia i vivo i Specc1l mutant tissues i le E9.5 embryonic arrest (Fig. 6A-D).O le faʻaitiitia o le maualuga o le phosphorylated Ser473-AKT atonu e mafua ona o le faʻaitiitia o le maualuga o le pan-AKT in vivo (FIG. 6E) ma in vitro (FIG. 6F).O le fa'aitiitia o le in vitro sa na'o le va'aiga o le U2OS sela ma suiga i foliga o le sela ma le mamafa o le AJ (Ata 6D).O le mea lea, o matou faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o le SPECC1L o se faʻatonuga lelei o le PI3K-AKT faʻailoga i le craniofacial morphogenesis.
(A–E) E8.5 (A,B) ma le E9.5 (C,D) vaega ulu po'o le E9.5 lysates mai Specc1l mutant embryos (E) o lo'o fa'aalia ai le maualuga o le S473-AKT phosphorylated malosi ma le pan-AKT Fa'aitiitiga Protein. , fa'atusatusa ile pulea WT.Western blotting na faia i luga o le vao-ituaiga lysates ma mutant lysates i lalo o tulaga tutusa.O ata o lo'o fa'aalia mo SPECC1L na pu'eina mai le poloka e tasi.Ole poloka lava lea e tasi na aveese ma toe suʻesuʻeina ile anti-pan-ACT ma le β-actin antibodies.Pan-AKT maualuga i le E8.5 neural folds (A, B) ma le maualuga o le phosphorylated S473-AKT i vaega o le ulupoo E9.5 na matua faʻaititia.(F) Pan-AKT maualuga na faʻaitiitiina tutusa i lysates o SPECC1L-kd U2OS sela e seleseleina i le maualuga o le faʻafefe.Fa'ailoga sese e fai ma sui o SEM mai fa'atusatusaga tuto'atasi e tolu i Western blot.(GJ) O vaega o le WT embryos i le E9.5 ua pisia i le KI67 ma vavae le caspase 3, faʻaalia, faʻaalia le faʻateleina o sela (G, G ') ma le laʻititi o gaioiga apoptotic (H, H ').Specc11 mutant embryos o loʻo faʻaalia le faʻatusatusaina o le faʻalauteleina o sela (I), ae o le numera o sela o loʻo i ai le apoptosis ua matua faʻateleina (J).
Ona matou suʻesuʻeina lea o faʻailoga o le faʻateleina ma le apoptosis.Matou te leʻi vaʻaia se eseesega i le faʻateleina o le E9.5 embryos (Fig. 6E, G faʻatusatusa i le I) faʻatasi ai ma le faʻasologa o le 82.5% mo WT mutants ma 86.5% mo Specc1l mutants fuaina e KI67 staining (p <0.56, Fisher's). su'ega sa'o).I se tulaga talitutusa, matou te leʻi matauina se eseesega i le apoptosis e fuaina e ala i le valiina o le caspase 3 i neural gauga i le E8.5 seia oʻo ina puʻeina embryo (e le o faʻaalia) (e le o faʻaalia).I le eseesega, o le apoptosis na matua faateleina i E9.5 mutant embryos uma (Fig. 6F, H ma J).O lenei faʻaopoopoga o le apoptosis e ogatasi ma le faʻaitiitia o le PI3K-AKT faʻailoga ma le vave faʻamaʻi oti29,30,31.
O le isi, ina ia faʻamaonia se mafuaʻaga mafuaʻaga mo le PI3K-AKT faʻailoga i suiga AJ i totonu o matou kd sela, matou te suia faʻamaʻi le ala i le pulea ma kd sela (Ata 7A-F).Na matou faʻaogaina le faʻailoga o le suiga o foliga o le sela o loʻo matauina i sela SPECC1L-kd faʻatasi, lea na matou faʻatusatusa i le faʻaogaina o le fua o le umi (umi) i le fua faʻatatau (lautele).Ole fua ole 1 o lo'o fa'amoemoeina mo sela lapotopoto po'o sela pupuni (Ata 7G).I le faʻaopoopoga i foliga o le sela, matou te faʻamaonia foi le aʻafiaga i luga o le AJ e ala i le β-catenin staining (Fig. 7A'-F').O le taofiofia o le ala PI3K-AKT e faʻaaoga ai le wortmannin na lava lea e suia ai foliga o le sela i sela pulea (Ata 7A,C) ma AJ (Ata 7A ').O le PI3K-AKT activator SC-79 e leʻi aʻafia ai foliga sela (FIG. 7A, E) poʻo le faʻalauteleina o le AJ (FIG. 7A ') i sela pulea.I sela SPECC1L-kd, o le toe taofiofia o le ala PI3K-AKT na mafua ai le faateleina o le apoptosis (Fig. 7B, D) ma le faʻailogaina o le faʻaogaina o le β-catenin staining (Fig. 7B '), e ogatasi ma a tatou in vivo heavy mutants.O le mea taua, o le faʻagaoioia o le ala PI3K-AKT na faʻaleleia atili ai foliga o le sela (Ata 7B, F) ma AJ phenotypes (Ata 7B").O suiga i foliga o le sela sa fa'atatauina o le fuafa'atatau o le lapotopoto (CCR) ma fa'atusatusa mo le taua e pei ona fa'amatalaina i luga (FIG. 7G).O le mea moni, i totonu o sela pulea (Fig. 7G, CCR = 1.56), na lava togafitiga wortmannin e matua suia ai le foliga o le sela (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) i le tulaga tutusa ma le mea na matauina. i SPECC1L.-kd sela (Ata. 7G, CCR = 3.46).Wortmannin togafitiga o sela SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, fa'atauva'a) e le'o sili atu lona taua nai lo sela kd e le'i togafitia (Fig. 7G, CCR = 3.46, fa'atauva'a) po'o sela fa'atonu e togafitia i le wortmannin (Fig 7G)., CCR = 3.46, fa'atauva'a) fa'aopoopo e a'afia ai le fa'aumiumi o sela (7G, CCR = 3.61, fa'atauva'a).O le mea pito sili ona taua, o le SC-79 AKT activator na toe faʻafoʻisia le phenotype elongated o sela SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).O nei faʻaiʻuga e faʻamaonia ai o le SPECC1L e faʻatonutonuina le PI3K-AKT faʻailoga ma fautua mai o le faʻaitiitia o le faʻaitiitia o le SPECC1L e aʻafia ai le pipii o le sela, ae o le paʻu malosi e tau atu i le apoptosis (Fig 8).
(A–F') Pulea (A, C, E) ma SPECC1L-kd (B, D, F) sela e togafitia i le PI3K-AKT auala inhibitor wortmannin (C, D) poʻo le SC-79 activator (E, F) Togafitiga .O sela faʻatonutonu e leʻi togafitia e faʻapipiʻi (A) faʻatasi ai ma β-cat cellular staining masani (A'), aʻo sela kd e faʻaumi (B) faʻatasi ai ma le faʻateleina o le β-cat staining (B').Ina ua uma le taofiofia o le ala PI3K-AKT, o sela pulea e faʻalautele (C) ma le faʻalauteleina o le β-cat (C'), aʻo amata ona maua e sela kd apoptosis (D), e tutusa ma a tatou embryos sili ona suia ma faʻaalia le faʻaleleia atili o le β-cat.fa'ailoga (D').Ina ua maeʻa le faʻagaoioia o le ala PI3K-AKT, o sela pulea na tumau pea i le cuboidal (E) ma e masani ona pisia β-cat (E'), ae o sela kd na faʻaalia le faʻaleleia atili o foliga o le sela (F) ma le β-cat (F'), faʻaalia. (G) O le tikeri o le suiga o foliga o le sela i totonu (AF) na fuaina e ala i le fua faatatau o le cell roundness (CCR) o le fua sili ona umi (umi) ma le fua fa'atatau i luga ole laiga (lautele) e fa'aoga ai le polokalama MetaMorph.Le togafitia (NT) SPECC1L-kd sela (CCR = 3.46) e sili atu le umi nai lo le pulea (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Wort's inhibition o le PI3K-AKT ala i totonu o sela pulea na lava e mafua ai se elongation tutusa i foliga sela (CCR = 3.61, p<2.4 × 10-9).E faʻapea foʻi, o le faʻamalosia o le AKT e le SC-79 i sela SPECC1L-kd na toe faʻaleleia ai le faʻalauteleina o le cell e pulea ai tulaga (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).O togafitiga Wortmannin o sela SPECC1L-kd na mafua ai le faateleina o le apoptosis ae leai se faʻaopoopoga o le suiga o foliga o le sela (CCR = 3.60) pe a faʻatusatusa i le kd e leʻi togafitia (CCR = 3.46, ns) poʻo le wortmannin-treated control cell (3.61) vaʻaia i .ns = e le afaina.+/- SEM fua mo 50 sela o loʻo faʻaalia.O eseesega fa'amaumauga sa fa'atatau ile su'ega-t a Tamaiti.
(A) Faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le faʻasaina ma le faʻagaoioia o le ala PI3K-AKT e mafua ai suiga AJ ma laveaʻi, i le faasologa.(B) Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'i mo le fa'amautuina o porotini AKT e le SPECC1L.
Premigratory CNCCs manaʻomia le AJ lysis e vavae ese mai neural fold neuroepithelial cells1,15,32.Faʻateleina le pisia o vaega o le AJ ma le leiloa o le apical-basal AJ asymmetric distribution i SPECC1L-le atoatoa sela i vitro ma in vivo, faʻatasi ma le vavalalata faaletino o le SPECC1L i le β-catenin, faʻaalia ai o le SPECC1L o loʻo galue e tausia lelei AJ mautu mo le lotoifale mo maso faalapotopotoga.actin cytoskeleton.O le fesoʻotaʻiga a le SPECC1L ma le actin cytoskeleton ma le β-catenin ma le faʻateleina o le numera o filaments actin condensed i le leai o SPECC1L e ogatasi ma le matauina o le faateleina o le AJ density.O le isi mea e mafai ona o le faateleina o le numera o alava actin i SPECC1L-le atoatoa sela e taʻitaʻia ai se suiga i le vaʻavaʻai vaʻaia.Talu ai ona o le mamafa o le telefoni feaveaʻi e aʻafia ai le malosi o le AJ 33, o suiga ole voltage e mafai ona iʻu ai i le tele o faʻasalalauga AJ 34.So'o se suiga la o le a a'afia ai le CNCC layers.
O le Wnt1 o loʻo faʻaalia i uluaʻi gaugau neural e faʻatupuina ai sela o le neural crest.O le mea lea, o le Wnt1-cre su'esu'eina o le gafa e fa'ailoga uma ai le NCC35 a'o le'i malaga mai.Ae ui i lea, Wnt1 faailoga foi dorsal brain tissue clones na maua mai i le amataga neural folds 35,36, e foliga mai o lo tatou staining o le E9.5 mutants mo Wnt1 faailoga i tatala neural gauga e le CNCC.O la matou faʻailoga lelei mo faʻailoga NCC AP2A ma SOX10 na faʻamaonia ai o gauga faʻaalia o Specc11 mutant embryos sa i ai moni lava CNCC.E le gata i lea, talu ai o AP2A ma SOX10 o faʻailoga o le vave faimalaga o le NCC, o le staining lelei na faʻaalia ai o nei sela o le CNCC post-migratory e le mafai ona faʻavasegaina e E9.5.
O matou faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o tulafono faatonutonu mole a le AJ e le SPECC1L o loʻo faʻatalanoaina e le PI3K-AKT faʻailoga.O fa'ailoga AKT ua fa'aitiitia i sela fa'aletonu SPECC1L ma masini.Saili e Fantauzzo et al.lagolago se matafaioi tuusaʻo mo le PI3K-AKT faʻailoga i le craniofacial morphogenesis.(2014) na faʻaalia ai o le leai o se faʻagaioiga o le PDGFRα-faʻavaeina PI3K-AKT faʻailoga e taʻitaʻia ai se faʻamaʻi palate phenotype.Matou te faʻaalia foi o le taofiofia o le ala PI3K-AKT ua lava lea e sui ai le AJ ma foliga o le cell i totonu o le U2OS.E ogatasi ma a tatou sailiga, Kaino et al.37 na faʻaalia ai o le faʻaitiitia o le PI3K α110 subunit i sela endothelial e maua ai se faʻaopoopoga tutusa i le pericellular β-catenin staining, e taʻua o le faateleina o le "faʻasinomaga fesoʻotaʻiga".Ae ui i lea, i totonu o sela endothelial o latou filament actin ua uma ona faʻatulagaina, o le taofiofia o le ala PI3K-AKT e maua ai se foliga gaogao.I se fa'atusatusaga, o sela SPECC1L-kd U2OS na fa'aalia ai se foliga fa'aumi.O lenei ese'esega e ono fa'apitoa ituaiga sela.E ui o le taofiofia o le PI3K-AKT faʻailoga e aʻafia ai le actin cytoskeleton, o le aʻafiaga i foliga o le cell e fuafua i suiga i le vevesi e mafua mai i suiga i le mamafa ma le faʻatulagaina o filo o le actin tutotonu.I sela U2OS, na matou fa'aaogaina na'o suiga o foliga o le sela e fai ma fa'ailoga o le SPECC1L-le atoatoa le suiga o le AJ ma le toe fa'aleleia.I le faaiuga, matou te manatu o le faʻasaina o le auala AKT i le SPECC1L deficiency e faʻateleina ai le faʻamautuina o le AJ ma faʻaitiitia ai le delamination i CNCC.
O le mea e malie ai, o le pan-AKT maualuga na faʻaititia i vitro ma in vivo i le faʻaopoopoga i le phosphorylated 473-AKT maualuga i le leai o SPECC1L, faʻamaonia le faʻatonutonuina o le PI3K-AKT faʻailoga i le maualuga o le faʻamautuina o le protein AKT poʻo le suiga.O genes SPECC1L ma MID1, e fesootaʻi uma ma le Opitz / GBBB syndrome, faʻapipiʻi polotini e faʻamautu ai microtubules 18,22 .Le faʻaogaina o le SPECC1L ma le MID1 faʻatautaia le microtubule stabilization e leʻo malamalama atoatoa.I le tulaga o le SPECC1L, o lenei faʻamautu e aofia ai le faʻaleleia o le acetylation o se vaega o microtubules 18.E mafai ona faʻaogaina e le SPECC1L se masini faʻapitoa e faʻamautu ai isi polotini e pei ole AKT.Ua faʻaalia o le acetylation o toega lysine i le porotini AKT e taʻitaʻia ai le faʻaitiitia o le faʻaogaina o le membrane ma le phosphorylation38.E le gata i lea, o le ubiquitination o le K63 filifili i le lysine tutusa i luga ole AKT e manaʻomia mo lona faʻaogaina o le membrane ma le faʻagaoioia39,40.Faatasi ai ma le tele o mea e fegalegaleai ma SPECC1L proteins ua faailoaina i le tele o le fefete maualuga e lua-hybrid screens, fa - CCDC841, ECM2942, APC ma UBE2I43 - ua aʻafia i le suiga o le porotini poʻo le mautu e ala i le ubiquitination poʻo le sumoylation.SPECC1L e mafai ona a'afia i le toe fa'aliliuina o le AKT lysine toega, e a'afia ai le mautu o le AKT.Ae ui i lea, o le taua tele o le SPECC1L i le faʻaogaina ma le mautu o le porotini AKT e tumau pea ona faʻamalamalamaina.
O fa'aletonu matuia i le fa'aaliga SPECC1L i vivo na mafua ai le fa'ateleina o le fa'ailoga o le AJ ma le fa'aletonu o le CNCC fa'apipi'i, fa'apea fo'i ma le fa'atuputeleina o le apoptosis ma le vave oti o le pepe.O lipoti talu ai ua faʻaalia ai o mutants o isumu ma le maualuga o le apoptosis e fesoʻotaʻi ma faʻafitauli o le neural tube 44,45,46,47 ma craniofacial defects48.Ua fautuaina e faapea o le tele o le oti sela i le neural gaugau po o pharyngeal arches e mafai ona iu i le le lava numera o sela e manaomia mo le morphogenetic gaoioiga talafeagai 48,49,50.I se fa'atusatusaga, o matou SPECC1L fa'aletonu laina sela ma fa'aitiitiga fa'aitiitiga SPECC1L fa'aalia na'o suiga AJ e aunoa ma se fa'amaoniga o le si'itia o le oti.Ae ui i lea, o vailaʻau faʻasaina o le PI3K-AKT ala i nei Kd sela na mafua ai le faʻateleina o apoptosis.O le mea lea, o le faʻaitiitia o le faʻaitiitia o le SPECC1L faʻamatalaga poʻo le galuega e mautinoa ai le ola ola.E o gatasi lea ma le matauina e seasea Specc11 mutant embryos e sola ese mai le pueina i St.E9.5-atonu ona o le faʻaitiitia o le malosi o le puʻeina o kene-e mafai ona tapuni a latou neural tubes ma taofi mulimuli ane i le atinaʻe, e masani ona iai ni faaletonu o le craniofacial (Fig. S3).E ogatasi foi ma lenei mea o le seasea tupu o heterozygous Specc1l embryos ma faaletonu craniofacial-atonu ona o le faateleina o le malosi o le pueina o kene-faapea foi ma le mauaina i le zebrafish lea e tasi o le SPECC1L orthologues e lua (specc1lb) e mafua ai le tuai o le embryonic phenotypes, e aofia ai le leiloa o le auvae pito i lalo ma va i itulua51.O le mea lea, o le heterozygous SPECC1L gau-o-galuega suiga ua iloa i tagata mamaʻi e mafai ona mafua ai ni faaletonu laiti i le SPECC1L galuega i le taimi o le craniofacial morphogenesis, e lava e faʻamatala ai o latou vaʻa.SPECC1L-faʻavae tulafono faatonutonu o fesoʻotaʻiga intercellular e mafai foi ona i ai se sao i le palatogenesis ma le fusuaga o faʻailoga o le pharyngeal.O isi suʻesuʻega o galuega a le SPECC1L o le a fesoasoani e faʻamalamalamaina le matafaioi o fesoʻotaʻiga le tumau i totonu o le CNCC i le taimi o le tapunia o le neural tube i le neuroepithelial cell motility ma le craniofacial morphogenesis.
U2OS osteosarcoma pulea ma SPECC1L-kd sela na faʻamatalaina muamua (Saadi et al., 2011).Antibodies e faasaga i le SPECC1L na faʻaalia foi muamua (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antibodies (lapiti; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) ( isumu; 1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalefonia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ma β-actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) na faʻaaogaina e pei ona faʻamatalaina..Actin filaments na pisia i Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS fa'atonutonu sela ma SPECC1L-kd sela sa fa'atupuina ile kulukose maualuga maualuga DMEM fa'aopoopo ile 10% fetal bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Mo suiga AJ, 2 x 105 sela na totoina i luga o tioata na togafitia i le 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ma matauina mo suiga i foliga o le sela.O sela na aoina i taimi eseese faʻaalia: 4 itula talu ona totoina (t = 1), 24 itula talu ona totoina (t = 2), faʻafeiloaʻi e aunoa ma se suiga i foliga sela (t = 3), suiga i foliga sela (t = 4) , 24 itula pe a uma le suiga o foliga o le sela (t = 5) ma le 48 itula pe a uma le suiga o foliga o le sela (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Ina ia faʻaogaina le ala PI3K-AKT, na faʻatupuina sela i faʻamatalaga faʻaalia ma le PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) poʻo le SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).O le ala o lo'o i ai vaila'au na suia i aso uma.
O fa'amaumauga fa'avaa-ma-fa'avaa na faia i luga o le fa'atonuga ola ma sela KD i lalo o tu'aiga masani, ma ata fa'atusatusa vaega sa aoina i 10 minute uma mo le 7 aso.O ata na maua mai i le faʻaogaina o le masini komepiuta Leica DM IRB faʻaogaina le microscope faʻapipiʻiina ma se masini faʻainisinia ma se faʻamoemoega 10 × N-PLAN e fesoʻotaʻi ma se mea pueata QImaging Retiga-SRV.I le taimi o faʻataʻitaʻiga, sa tausia aganuʻu sela i le 37 ° C i se siosiomaga susu ma le 5% CO2.
E lua mailei kenera ES laina sela DTM096 ma RRH048 mai le Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) na faʻaaogaina e faʻatupu ai laina ole isumu Specc11, ua filifilia Specc1lgtDTM096 ma Specc1lgtRRH046.I se faapuupuuga, 129 / REJ ES sela na tui ile C57BL6 blastocysts.O le mea na maua mai i isumu tama chimeric na fafaga i isumu fafine C57BL6 e iloa ai fanau e iai le lanu o le ofu talaloa.O le i ai o faʻapipiʻi faʻapipiʻi mailei faʻapipiʻi na faʻaaogaina e iloa ai heterozygotes.O isumu na teuina i luga o le faʻafefiloi o le 129/REJ;C57BL6.O le nofoaga o le faʻapipiʻiina o le faʻaogaina o le mailei faʻasolosolo na faʻamaonia e le RT-PCR, faʻasologa o le genome, ma le faʻaogaina o le kenera (Ata Faʻaopoopo 1).Ina ia su'eina le gafa CNCC o lua heterozygous Specc1lGT isumu, ROSAmTmG (#007576) ma Wnt1-Cre (#003829) isumu (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) na sopoia e maua ai le ROSAmTmG ma Wnt1-Cre allele i Specc1l muce.O faʻataʻitaʻiga uma i isumu na faia e tusa ai ma faʻamaumauga na faʻamaonia e le Komiti Faʻatonu Faʻatonu ma Faʻaoga Faʻatonu a le Iunivesite o Kansas Medical Center.
Embryos na faʻamauina i (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) mo le 60 min i le vevela o le potu.A maeʻa le faʻapipiʻiina i le X-gal staining solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Na faia le atinaʻeina o pisia ile 37 ° C .°C i totonu ole 1-6 itula.Embryos na mae'a fa'amaumau ile 4% PFA ma va'aia.
Mo Western blotting, sela na lysed i le pasive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) faaopoopo i se paluga o HALT inhibitors protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates na gaosia i luga ole 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ua saunia gels (Bio-Rad, Hercules, CA) ma faʻafeiloaʻi i Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA).O paʻu na poloka ile 5% susu ile PBS o loʻo iai le 0.1% Tween.O mea fa'ama'i e fa'asusu i le po i le 4°C po'o le tasi le itula i le vevela o le potu.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) na faʻaaogaina mo le faʻatupuina o faailo.Mo immunostaining, embryos na faʻamauina i le po i le 4% PFA / PBS ma cryopreserved.Tissue cryosections na poloka i le PBS o loʻo i ai le 1% serum 'oti masani (Thermo Scientific, Waltham, MA) ma le 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ona faʻapipiʻiina lea i le 4 ° C i totonu o se incubator i le taimi o le po.fa'atasi ai ma anti-antibody ma fa'amalama fa'amalama lua fa'ama'i (1:1000) mo le 1 itula ile 4°C.Na tu'u vaega fa'ailoga i totonu ole ProLong gold medium (Thermo Scientific, Waltham MA) ma ata mafolafola na maua mai ile fa'aogaina ole Leica TCS SPE confocal microscope.Ta'itasi immunostaining sa faia o ni fa'ata'ita'iga tuto'atasi se tolu i fa'amama a le itiiti ifo ma le lua mutant embryos.Ua fa'aalia se fa'ata'ita'iga fa'atusa.
O sela na faʻapipiʻiina i le suiga o le RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, ma le HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) I se faapuupuuga, lysates sa muai faamamaina i polotini G mageta lopa (Life Technologies, Carlsbad, CA) ona incubated i le po i le 4° C. faatasi ai ma anti-SPECC1L po o IgG protein G polotini lopa sa faaaoga e aveese SPECC1L ma Western blotting sa faia e faaaoga ai le anti. -β-catenin antibody o loʻo faʻamatalaina i luga O faʻataʻitaʻiga co-IP o loʻo faʻaalia e fai ma sui o faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi e fa.
Na tu'uina atu sela fa'aa'oa'o fa'atutu po'o auga o le tama'i isumu i le nofoaga fa'aeletonika microscopy i le Iunivesite o Kansas Medical Center.I se faapuupuuga, o faʻataʻitaʻiga na faʻapipiʻiina i le EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized i le po i le 60 ° C, ma vaega i le 80 nm e faʻaaoga ai le Leica UC7 ultramicrotome faʻapipiʻiina i se mata taimane.O vaega na faʻaalia i le faʻaaogaina o le JEOL JEM-1400 transmission electron microscope faʻapipiʻiina ma le 100 kV Lab6 fana.
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